喬 慧，盧 柯，楊世玲，薛楚然，劉樹文,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 7 12100）

中國主要葡萄酒產(chǎn)區(qū)酒酒球菌糖苷酶活性

喬 慧1，盧 柯1，楊世玲1，薛楚然1，劉樹文1,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 7 12100）

在蘋果酸乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）過程中，一些酒酒球菌產(chǎn)生的糖苷酶活性受葡萄酒環(huán)境的影響，篩選并利用在釀酒環(huán)境中具有高活力糖苷酶的菌株進行MLF，有助于提升葡萄酒的香氣復(fù)雜性。本實驗以中國5 個釀酒產(chǎn)區(qū)19 株釀酒特性優(yōu)良的酒酒球菌和一株商業(yè)菌為實驗菌株，通過測定5 種糖苷酶活性，對其中5 株糖苷酶活性高的菌株研究其在葡萄酒環(huán)境中糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：20 株菌在相應(yīng)底物作用下均含有可檢測到的糖苷酶活力，不同菌株酶活性差異顯著，地 區(qū)間差異不顯著。5 株糖苷酶活性高的菌株最適pH值為4.0，最適溫度為45 ℃，在低水平（4%乙醇+0.1 g/100 mL果糖）時有促進作用，高水平（1 4%乙醇+2 g/100 mL果糖）時抑制作用顯著，葡萄糖則表現(xiàn)為抑制作用，但各種酶活性表現(xiàn)為菌株依賴性。在模擬酒條件下，菌株相對酶活力僅是菌株酶活力的9.805%～32.331%。總之，在所選菌株中，SD-1f在葡萄酒環(huán)境中的糖苷酶活性最高。

葡萄酒；酒酒球菌；糖苷酶活性

在葡萄酒釀酒體系中，有兩類微生物發(fā)揮重要作用，即酵母菌和乳酸菌，其分別進行酒精發(fā)酵（alcohol fermentation，AF）和蘋果酸乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）。釀酒酵母可產(chǎn)多種酶，但糖苷酶并不是主要的酶，且在AF過程中，糖苷酶活性受葡萄糖的 顯著抑制[1]。而一些非釀酒酵母具有大量的β-葡萄糖苷酶活力，但僅局限于AF開始階段，隨接種釀酒酵母的生長，非釀酒酵母的數(shù)量急劇下降[2]。因此，酵母菌對糖苷類香氣的釋放作用有限。

乳酸菌對葡萄酒中香氣的形成具有重要影響，在MLF過程中可增加香氣的復(fù)雜性，因為酒酒 球菌能夠較好地適應(yīng)葡萄酒中的低pH值和高酒精度等環(huán)境，在多數(shù)MLF過程中起主導(dǎo)作用[3]。研究表明，酒酒球菌可產(chǎn)糖苷酶，通過水解 葡萄糖苷（香氣前體）釋放香氣物質(zhì)，增加并改良葡萄汁和葡萄酒的花香和果香，并產(chǎn)生濃郁、自然的葡萄酒香氣[4]。Guilloux-Benatier等[5]首次報道了關(guān)于酒酒球菌β-D-葡萄糖苷酶的研究，目前已經(jīng)有大量相關(guān)研究[6-11]。Grimaldi等[12]在2000年首次提出多酶的存在，為了證實這一猜想，他們利用其他底物對22 株商業(yè)菌株的專一酶活性進行測定，證實酒酒球菌中存在葡萄糖苷酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶和低含量的鼠李糖苷酶，盡管糖苷酶的種類是菌株依賴性的。

葡萄漿果中存在著游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩類香氣物質(zhì)，游離態(tài)香氣物質(zhì)可以直接從葡萄酒中揮發(fā)出來，使人產(chǎn)生嗅覺反應(yīng)；結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)沒有香氣，必須經(jīng)過分解釋放出游離態(tài)呈香物質(zhì)才能產(chǎn)生香氣[13]。通常，后者含量比前者要豐富得多。結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)由糖基和糖苷配基組成，糖基通常是β-D-葡萄糖、α-D-葡萄糖、β-D-木糖、β-芹菜糖、α-L-阿拉伯糖和α-L-鼠李糖[14]；糖苷配基包括單萜烯、C13-降異戊二烯、苯衍生物和脂肪族化合物，是對葡萄酒香氣有貢獻的物質(zhì)[14-16]。其中萜烯類化合物是一些葡萄酒香氣中最重要的組成部分，例如在麝香葡萄、瓊瑤漿、雷司令和瑪爾維薩葡萄酒中[12,17]。

葡萄酒中結(jié)合態(tài)香氣前體可通過酸解、熱水解或酶解釋放出揮發(fā)性的糖苷配基[12,15]，其中酶解是一種更接近于自然、溫和的方法，極具商業(yè)化應(yīng)用前景，一般采用酶解的方法來增強葡萄酒香氣[4,18]。糖苷酶對葡萄糖苷的水解，可一步反應(yīng)，也可兩步反應(yīng)（順序水解）。在順序水解模式中，首先一種外切糖苷酶（α-L-鼠李糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、β-D-芹菜糖苷酶或β-D-木糖苷酶）切斷糖內(nèi)連接，釋放出相應(yīng)的糖和一個β-D-葡萄糖苷，隨后β-D-葡萄糖苷酶催化β-D-葡萄糖苷的水解，釋放出相應(yīng)的糖苷配基和葡萄糖；在一步反應(yīng)模式中，雙葡萄糖苷酶催化糖苷配基與二糖苷之間的連接，從而釋放出相應(yīng)的糖苷配基和二糖[19]。α-D-葡萄糖苷酶可降解酵母菌衍生的大分子物質(zhì)，為乳酸菌生長提供營養(yǎng)物質(zhì)[5,16]。

綜上所述，葡萄酒中的酒酒球菌可通過糖苷酶水解葡萄糖苷釋放 香氣物質(zhì)，影響葡萄酒香氣質(zhì)量。盡管許多學(xué)者已經(jīng)證明乳酸菌能夠促進香氣化合物釋放，但關(guān)于參與反應(yīng)的酶的種類的知識卻相對較少[20]，且僅有少量菌株對多種底物有持續(xù)穩(wěn)定的高活性。因此，研究各種釀酒參數(shù)和葡萄酒環(huán)境對糖苷酶活性的影響，可在菌株篩選時預(yù)測菌株在釀酒中發(fā)揮的作用以及它對葡萄酒香氣特性的影響，減少乳酸菌對葡萄酒產(chǎn)生的負(fù)面影響，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院保存的中國5 個釀酒產(chǎn)區(qū)的優(yōu)良酒酒球菌，包括山東7 株（SD-1a、SD-2a、SD-1b、SD-1g、SD-1f、SD-2gh、SD-2h）、新疆3 株（XJ-2a、XJ-2b、XJ-3a）、陜西2 株（SX-1b、SX-1a）、河北4 株（HB-1a、HB-1b、HB-1c、HB-2b）、寧夏3 株（NX-1e、NX-4b、NX-3g）和商業(yè)菌株1 株（31-DH）。

1.2 試劑

ATB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g、酵母浸粉 5 g、葡萄糖 10 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、鹽酸半胱氨酸 0.5 g、番茄汁體積分?jǐn)?shù)25%，蒸餾水定容至 1 000 mL，pH值調(diào)至4.8，121 ℃滅菌20 min。

底物：對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（p-nitro-phenyl β-D-glucopyranoside，pNP-βGlu）、對硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（p-nitro-phenyl α-D-glucopyranoside，pNP-αGlu）、對硝基苯酚-β-D-木糖苷（p-nitro-phenyl β-D-xylopyranoside，pNP-βXyl）、對硝基苯酚-α-L-鼠李糖苷（p-nitro-phenyl α-L-rhamnopyranoside，pNP-αRha）和對硝基苯酚-α-L-阿拉伯糖苷（p-nitro-phenyl α-L-arabinofuranoside，pNP-αAra）購買于美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；5417R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；MJ-250B恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠。

1.4 方法

1.4.1 菌株活化

酒酒球菌在ATB培養(yǎng)基26 ℃進行2 次連續(xù)活化培養(yǎng)，隨后接種于ATB液體培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)。通過測定600 nm波長處的光密度（OD）值了解細(xì)菌的生長情況，當(dāng)OD600nm接近1時，將培養(yǎng)液放置于4 ℃冰箱中過夜。

1.4.2 酒酒球菌糖苷酶活性測定

本實驗改進了Grimaldi等[7,12]所用的酒酒球菌糖苷酶活性測定方法，反應(yīng)總體積為80 μL，其中每個反應(yīng)包括McIlvane緩沖液40 μL，菌懸液20 μL，底物溶液20 μL。

菌懸液制備：從ATB擴大培養(yǎng)基中吸取3 mL培養(yǎng)液，于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，收集菌體，用0.85 g/100 mL NaCl溶液重懸，重復(fù)2 次操作，最后使菌體密度OD600nm≈0.5，并測定菌密度OD600nm值。

McIlvane緩沖液制備：由0.1 mol/L檸檬酸和0.2 mol/L磷酸氫二鉀配制而成，緩沖液濃度為0.2 mol/L，pH值為4.0。

底物溶液制備：分別配制對硝基苯基β-D-葡萄糖苷（pNP-βGlu）10 mmol/L、對硝基苯基α-D-葡萄糖苷（pNP-αGlu）10 mmol/L、對硝基苯基β-D-木糖苷（pNP-βXyl）7.5 mmol/L、對硝基苯基α-L-鼠李糖苷（pNP-αRha）7.5 mmo/L、對硝基苯基α-L-阿拉伯糖苷（pNP-αAra）7.5 mmol/L。

反應(yīng)體系混合均勻，于37 ℃條件下反應(yīng)1 h，隨后立即加入160 μL的Na2CO3（0.5 mmol/L）終止反應(yīng)并顯色，放置至室溫，2 500 r/min離心18 min ，吸取200 μL上清液至另一離心管中。在400 nm波長處用UV-2450紫外分光光度計測定上清液的OD值，重復(fù)3 次?？瞻诪镸cIlvane緩沖液替代菌懸液的反應(yīng)體系，其他處理相同。

酶活力單位定義：以各種糖苷酶對應(yīng)的糖苷為特異性底物，1 min內(nèi)每1 g/L菌體細(xì)胞水解相應(yīng)底物生成1 μmol/L對硝基苯酚（pNP）定義為一個酶活力單位（U）。

1.4.3 糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.4.3.1 pH值對糖苷酶活性的影響

用1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)McIlvane緩沖液，設(shè)定pH值梯度為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，在上述反應(yīng)條件下測定酶活力。

1.4.3.2 溫度對糖苷酶活性的影響

通過恒溫水浴鍋設(shè)定溫度梯度，分別設(shè)為 15、25、35、45、55 ℃，在上述反應(yīng)條件下測定酶活力。

1.4.3.3 乙醇、葡萄糖和果糖對糖苷酶活性的影響

分別設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)（4%、8%、12%、14%）、葡萄糖質(zhì)量濃度（0.1、0.4、0.75、2 g/100 mL）和果糖質(zhì)量濃度（0.1、0.4、0.75、2 g/100 mL），在上述反應(yīng)條件下測定酶活力，對照為未加乙醇、葡萄糖和果糖所測的酶活力，即菌株糖苷酶活性測定中所測得的酶活力，設(shè)定其相對酶活力為100%。

1.4.3.4 模擬酒對糖苷酶活性的影響

模擬酒配方為[16]：酒精度11%、葡萄糖 2 g/L、果糖 2 g/L、pH 3.5，20 ℃反應(yīng)1 h后測定酶活力，對照為菌株糖苷酶活性測定中所測得的酶活力，設(shè)定其相對酶活力為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒酒球菌的糖苷酶活性

由表1可知，2 0 株酒酒球菌在5 類糖苷酶相應(yīng)糖苷底物作用下，都有可檢測 到的糖苷酶活力（0.815～50.3 45 μmol/（g·min））。β-D-葡萄糖苷酶的平均酶活力為6.197 μmol/（g·min），菌株 間差異顯著，最高酶活力（NX-3g）是最低酶活力的3 倍，其中商業(yè)菌株31-DH的酶活力為7.733 μmol/（g·min），在所測菌株中酶活性相對較高。對于α-D-葡萄糖苷酶活性，平均酶活力為39.126 μmol/（g·min），是β-D-葡萄糖苷酶的6 倍，且最高酶活力是β-D-葡萄糖苷酶最高酶活力的5 倍，菌株間的差異顯著。此外，這兩種酶活性沒有直接聯(lián)系，例如XJ-1a、XJ-3a兩種酶活性都很低，而一些菌株具有較高的β-D-葡萄糖苷酶、較低的α-D-葡萄糖苷酶活性（NX-3g、SX-1a），其他菌株也有相反的情況（SD-1g、SD-2a）。對其他3 種糖苷酶的測定也可以得出：β-D-木糖苷酶的平均酶活力是β-D-葡萄糖苷酶活性的2 倍，α-L-阿拉伯糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的活性都較小，但所有菌株都可以檢測得到。由此可以推測，5 類糖苷酶活性的總體趨勢為：α-D-葡萄糖苷酶＞β-D-木糖苷酶＞β-D-葡萄糖苷酶＞α-L-阿拉伯糖苷酶≥α-L-鼠李糖苷酶。

表1 酒酒球菌糖苷酶活性Table1 Glycosidase activities of Oenococcus oeni

同時通過對地區(qū)間的差異顯著性分析，可以得出對底物pNP-βGlu、pNP-αGlu、pNP-βXyl、pNP-αAra和pNP-αRha地區(qū)間差異顯著性分別為0.293、0.109、0.117、0.109和0.874，差異不顯著（P＞0.05）。因此 地區(qū)不能作為區(qū)分菌株糖苷酶活性高低的依據(jù)。

眾所周知酒酒球菌處于葡萄酒惡劣、復(fù)雜的環(huán)境中，如低pH值、低溫、高乙醇體積分?jǐn)?shù)及葡萄糖和果糖等因素都可能對糖苷酶的活性產(chǎn)生影響，因此有必要對菌株在單因素條件下糖苷酶活性的變化進行研究。本實驗中以β-D-葡萄糖苷酶和α-D-葡萄糖苷酶為依據(jù)，根據(jù)表1測定結(jié)果，選取酶活性高的5 株菌（NX-3g、SX-1a、SD-1f、HB-1c、31-DH），研究各因素對酶活性的影響。

2.2 pH值對糖苷酶活性的影響

圖1 pH值對酒酒球菌糖苷酶活性的影響Fig.1 Effect of pH on glycosidase activities of Oenococcus oeni

葡萄酒的pH值是影響酒酒球菌生存與生長最重要的因素之一，同樣也會影響到糖苷酶的活性。由圖1可知，從總體上來看，pH值對5 株酒酒球菌糖苷酶活性有顯著影響。對β-D-葡萄糖苷酶，菌株在pH 4.0時酶活性最高，最高酶活力是最低酶活力的7 倍。對α-D-葡萄糖苷酶，在pH 2.5時，酶活性幾乎為零；隨pH值升高，抑制作用減弱，在pH 4.0時達(dá)最大；大于pH 4.0時，酶活性緩慢下降。對其他3 種酶可以看出：在pH 4.0和5.5有兩個峰值，在小于pH 4.0時，菌株糖苷酶活性受到顯著抑制。因為葡萄果實中含有大量的與鼠李糖連接的香氣物質(zhì)，鼠李糖苷酶在釀酒過程中發(fā)揮重要作用[21]，但從圖中可以看出，其對底物的水解作用較弱，最高酶活力僅為5.419 μmol/（g·min）。就這一參數(shù)而言，各酶活性是菌株依賴性的。葡萄酒的pH值通常為3.0～4.0，在此pH值時糖苷酶活性受抑制，只有低含量的酶活性。

2.3 溫度對糖苷酶活性的影響

圖2 溫度對酒酒球菌SX-1a（A）和SD-1f（B）糖苷酶活性的影響Fig.2 Effect of temperature on glycosidase activities of Oenococcus oeni

考慮到釀酒過程中溫度通常是在10～30 ℃，因此測定了溫度對糖苷酶活性的影響。雖然不同菌株的酶活性不同，但是隨溫度變化的總體趨勢基本一致，所以選擇2 株菌SX-1a和SD-1f為代表，測定結(jié)果見圖2，5 種酶的最適溫度都在45 ℃左右，在溫度小于最適溫度時，隨溫度升高酶活性相應(yīng)增加，隨著溫度接近55 ℃所有糖苷酶活性迅速下降。MLF過程溫度通常控制在20～23 ℃，在此溫度下2 株菌只有較低的酶活性。

2.4 乙醇、葡萄糖和果糖對糖苷酶活性的影響

乙醇和糖（包括葡萄糖、果糖）通常被認(rèn)為對糖苷酶活性有抑制作用[15,22]。因此，本實驗測定了這些物質(zhì)對糖苷酶的影響，結(jié)果見圖3。

葡萄酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)通常小于15%，大量的研究已經(jīng)證明乙醇對糖苷酶活性的影響取決于菌株和乙醇體積分?jǐn)?shù)[7,22]。目前有2 種乙醇對糖苷酶活性影響的機制，一種認(rèn)為乙醇作為一種關(guān)鍵糖基中間物，當(dāng)它的體積分?jǐn)?shù)增加時，可以增加此酶的糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)速率；另一種解釋認(rèn)為乙醇可能改變膜通透性，促進細(xì)胞內(nèi)酶和底物的接觸[22]，酶活性下降可能由酶變性失活引起[15]。由圖3可知，在4%乙醇體積分?jǐn)?shù)時，SD-1f的β-D-葡萄糖苷酶的相對酶活力為112%，高于對照，其他菌株都低于對照，說明菌株對乙醇的耐受性是菌株依賴性的，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，酶活性迅速下降；所有菌株α-D-葡萄糖苷酶在設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)下都受到抑制；低體積分?jǐn)?shù)（4%和8%）可促進β-D-木糖苷酶活性；所有菌株α-L-鼠李糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶在測定濃度條件下也受到抑制，后者受抑制程度更顯著，SX-1a在體積分?jǐn)?shù)14%抑制程度大于95%。就這一參數(shù)而言，可以推斷SD-1f在葡萄酒乙醇體積分?jǐn)?shù)12%和14%條件下菌株酶活性保持最高。

圖3 乙醇、葡萄糖和果糖對酒酒球菌糖苷酶活性的影響Fig.3 Effects of alcohol, glucose and fructose on glycosidase activities of Oenococcus oeni

大量研究已經(jīng)證明葡萄糖和果糖會降低多 種來源菌株的糖苷酶活性[6,23]。葡萄糖即使在最低測定質(zhì)量濃度0.1 g/100 mL時，5 種糖苷酶活性都受到不同程度的抑制，β-D-葡萄糖苷酶活力下降幅度為12%～40%，α-D-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶活力僅是對照的50%。與本實驗測定結(jié)果一致，Williams等[24]證明葡萄酒中葡萄糖質(zhì)量濃度即使小于0.40 g/100 mL仍對糖苷酶活性有抑制作用。隨葡萄糖質(zhì)量濃度增加，酶活性抑制作用增強，但不呈線性關(guān)系，其中α-D-葡萄糖苷酶和β-D-木糖苷酶下降不顯著，其他3 種酶活性受抑制顯著。從總體來看，SD-1f受影響最小，NX-3g受影響最大。

與葡萄糖類似，果糖的典型反應(yīng)也是抑制，盡管從總體來看降幅小于葡萄糖，但不同菌株受果糖的影響也不同。對菌株31-DH和NX-3g，即使在最低質(zhì)量濃度（0.1 g/100 mL），β-D-葡萄糖苷酶活性也受到抑制，而菌株SX-1a和SD-1f酶活性增強。在測定質(zhì)量濃度下，所有菌株的α-D-葡萄糖苷酶活性都受到顯著抑制，僅是對照的50%，但隨質(zhì)量濃度增加活性減小程度不顯著。對β-D-木糖苷酶，菌株SD-1f表現(xiàn)最為突出，基本上不受果糖的影響，其他菌株都受果糖的抑制，降幅小于α-D-葡萄糖苷酶。α-L-阿拉伯糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶在低質(zhì)量濃度（0.10 g/100 mL和0.40 g/100 mL）時，一些菌株表現(xiàn)為促進作用，隨果糖質(zhì)量濃度升高至2.00 g/100 mL時，最高酶活力分別僅是對照的44%和46%。

2.5 模擬酒對糖苷酶活性的影響

在大部分情況下，葡萄酒中酒酒球菌通常都處于上述各因素的綜合作用下。為了研究這些參數(shù)的綜合作用，測定了在模擬酒環(huán)境中菌株的糖苷酶活性，結(jié)果見表2，菌株的相對酶活力僅是菌株酶活力的9.805%～32.331%，從總體來看，菌株SD-1 f受模擬酒環(huán)境條件影響最小，與單因素測定結(jié)果一致，β-D-葡萄糖苷酶活力為2.422 μmol/（g·min），是對照的31.046%。與本實驗測定結(jié)果類似的，Grimaldi等[7,22]報道多種釀酒參數(shù)（pH值、乙醇、糖和溫度）共 同作用會增強對糖苷酶的抑制作用，同時，不同菌株對參數(shù)的反應(yīng)也不同。

表2 模擬酒環(huán)境對酒酒球菌糖苷酶活性的影響Table2 Effect of model wine environment on glycosidase activities of Oenococcus oeni

3 結(jié) 論

本研究證明酒酒球菌不僅普遍產(chǎn)糖苷酶，而且糖苷酶種類不局限于β-D-葡萄糖苷酶。20 株酒酒球菌在5 類糖苷酶相應(yīng)糖苷底物作用下，都有可檢測到的糖苷酶活力，且5 類糖苷酶活性的總體趨勢為：α-D-葡萄糖苷酶＞β-D-木糖苷酶＞β-D-葡萄糖苷酶＞α-L-阿拉伯糖苷酶≥α-L-鼠李糖苷酶。α-D-葡萄糖苷酶活性最高，為乳酸菌生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進生長；β-D-葡萄糖苷酶是提升葡萄酒香氣的關(guān)鍵酶，在篩選菌株時應(yīng)優(yōu)先考慮；α-L-鼠李糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶活性很低，而葡萄果實中卻含有較多的與鼠李糖連接的二糖類化合物，抑制了香氣的釋放。地區(qū)間差異分析結(jié)果為不顯著，不能作為區(qū)分菌株糖苷酶活性的依據(jù)。

通過對潛在的抑制參數(shù)pH值、溫度和葡萄酒組分（乙醇、葡萄糖和果糖）對5 種糖苷酶活性影響的研究表明，影響作用介于輕微促進和強烈抑制之間。5 種糖苷酶在pH 4.0都有一個峰值，在葡萄酒的pH值范圍內(nèi)，只有較低的活性；糖苷酶最適溫度都在45 ℃左右；乙醇和果糖在低水平（4%，0.1 g/100 mL）時有促進作用，高水平（14%，2.00 g/100 mL）時抑制作用顯著，葡萄糖則表現(xiàn)為抑制作用，但各種酶活性表現(xiàn)為菌株依賴性。通過測定模擬酒條件下菌株的糖苷酶活性，有助于了解工業(yè)生產(chǎn)中酶的潛在活性。從本實驗研究結(jié)果看，SD-1f在葡萄酒環(huán)境中糖苷酶活性最高。

總之，只有少數(shù)酒酒球菌對測定的底物表現(xiàn)出持續(xù)高活性，而葡萄酒的組成成分相當(dāng)復(fù)雜，在實際生產(chǎn)中菌株酶活性受環(huán)境的綜合影響更大，所以在菌株篩選時需要慎重考慮菌株在葡萄酒環(huán)境中的生長狀況和它對葡萄酒糖苷修飾方面的應(yīng)用，同時也突出了在后續(xù)工作中進行糖苷酶純化接種發(fā)酵的重要性。

[1] BARTOWSKY E, HENSCHKE P, PRETORIUS I. Chasing wine aroma: does Oenococcus oeni have the potential to release aroma compounds from authentic grape precursors[J]. Wine Industry Journal, 2004, 19(2): 24-31.

[2] SWANGKEAW J, VICHITPHAN S, BUTZKE C E, et al. Characterization of β-glucosidases from Hanseniaspora sp. and Pichia anomala with potentially aroma-enhancing capabilities in juice and wine[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010, 27(2): 423-430.

[3] 李華. 葡萄酒工藝學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2007: 94-121.

[4] GUEGUEN Y, CHEMARDIN P, JANBON G, et al. A very efficient β-glucosidase catalyst for the hydrolysis of flavor precursors of wines and fruit juices[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44(8): 2336-2340.

[5] GUILLOUX-BENATIER M, SON H S, BOUHIER M F. Activités enzymatiques: glycosidases et peptidases chez Leuconostoc oenos a u cours de la croissance bactérienne. Influence des macromolécules des levures[J]. Vitis, 1993, 32: 51-57.

[6] MESAS J M, RODRIGUEZ M C, ALEGRE M T. Basic characterization and partial purification of beta-glu cosidase from cell-free extracts of Oenococcus oeni ST81[J]. Letters in Applied Microbiology, 2012, 55(3): 247-255.

[7] GRIMALDI A, BARTOWSKY E, JIRANEK V. A survey of glycosidase activities of commercial wine strains of Oenococcus oeni[J]. International Journal of F ood Microbiology, 2005, 105(2): 233-244.

[8] BOIDO E, LLORE T A, MEDINA K, et al. Effect of beta-glycosidase activity of Oenococcus oeni on the glycosylated flavor precursors of Tannat wine during malolactic fermentation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50: 2344-2 349.

[9] UGLIANO M, GENOVESE A, MOIO L. Hydrolysis of wine aroma precursors during malolactic fermentation with four commercial starter cultures of Oenococcus oeni[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(17): 5073-5 078.

[10] D’INCECCO N, BARTOWSKY E, KASSARA S, et al. Release of glycosidically bound flavour compounds of chardonnay by Oenococcus oeni during malolactic fermentation[J]. Food Microbiology, 2004, 21(3): 257-265.

[11] MCMAHON H, ZOECKLEIN B W, FUGELSANG K, et al. Quantification of glycosidase activities in selected yeasts and lactic acid bacteria[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 1999, 23: 198-203.

[12] GRIMALDI A, BARTOWSKY E, JIRANEK V. Screening of Lactobacillus spp. and Pediococcus spp. for glycosidase activities that are important in oenology[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(5): 1061-1069.

[13] PEREZ-MARTIN F, SESENA S, IZQUIERDO P M, et al. Screening for glycosidase activities of lactic acid bacteria as a biotechnological tool in oenology[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(4): 1423-1432.

[14] GAGNE S, LUCAS P M, PERELLO M C, et al. Variety and variability of glycosidase activities in an Oenococcus oeni strain collection tested with synthetic and natural substrates[J]. Journal of Applied Microbiology, 2011, 110(1): 218-228.

[15] BARBAGALLO R N, SPAGNA G, PALMERI R, et al. Assessment of β-glucosidase activity in selected wild strains of Oenococcus oeni for malolactic fermentation[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2004, 34(3/4): 292-296.

[16] HERNANDEZ-ORTE P, CERSOSIMO M, LOSCOS N, et al. Aroma development from non-floral grape precursors by wine lactic acid bacteria[J]. Food Research International, 2009, 42(7): 773-781.

[17] MATE O J J, JIMNEZ M. Monoterpenes in grape juice and wines[J]. Journal of Chromatography A, 2000, 881(1): 557-567.

[18] CASTRO VáZQUEZ L, PéREZ-COELLO M S, CABEZUDO M D. Effects of enzyme treatment and skin extraction on varietal volatiles in Spanish wines made from Chardonnay, Muscat, Airén, and Macabeo grapes[J]. Analytica Chimica Acta, 2002, 458(1): 39-44.

[19] GUNATA Z Y, BITTEUR S, BRILLOUET J M, et al. Sequential enzymic hydrolysis of potentially aromatic glycosides fr om grape[J]. Carbohydrate Research, 1988, 184: 139-149.

[20] MICHLMAYR H, SCHUMANN C, da SILVA N M, et al. Isolation and basic characterization of a beta-glucosidase from a strain of Lactobacillus brevis isolated from a malolactic starter culture[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 108(2): 550-559.

[21] VOIRIN S G, BAUMES R L, SAPIS J C, et al. Analytical methods for monoterpene glycosides in grape and wine: Ⅱ. Qualitative and quantitative determination of monoterpene glycosides in grape[J]. Journal of Chromatograph y A, 1992, 595(1): 269-281.

[22] GRIMALDI A, MCLEAN H, JIRANEK V. Identification and partial characterization of glycosidic activities of commercial strains of the lactic acid bacterium, Oenococcus oeni[J]. American Society for Enology and Vi ticulture, 2000, 51(4): 362-369.

[23] MICHLMAYR H, EDER R, KULBE K D, et al. β-Glycosidase activities of Oenococcus oeni: current state of research and future challenges[J]. Mitteilungen Klosterneuburg, 2012, 62: 87-96.

[24] WILLIAMS P J, SEFTON M A, MARINOS V A. Hydrolytic flavor release from non-volatile precursors in fruits, wines and some other plant-derived foods[J]// HOPP R, MORI K. Recent developments in flavor an d fragrance chemistry. 1993, 52(1): 283-290.

Glycosidase Activities of Oenococcus oeni from Major Wine-Producing Regions in China

QIAO Hui1, LU Ke1, YANG Shi-ling1, XUE Chu-ran1, LIU Shu-wen1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

The wine-related lactic acid bacteria, especially Oenococcus oeni, can produce glycosidase and release volatile aroma compounds through hydrolysis of grape-deriv ed aroma precursors by undertaking malolactic fermentation (MLF), thus improving the aroma complexity of the wine. To investigate five glycosidase activities, 19 strains of O. oeni from five wine-producing regions in China and a commercial strain were selected, and then five strains with higher glycosidase activities were used to explore glycosidase properties in model wine environment. The results showed that all these 20 strains produced detectable glycosidase activities towards the corresponding substrates. Significant differences were observed among different strains, while no difference was observed among different wine regions. The optimum pH was 4.0 and optimum temperature was 45 ℃ for glycosidase. Ethanol and fructose could stimulate at lower concentrations (4% ethanol + 0.1 g/100 mL fructose) but significantly inhibit at higher concentrations (14% ethanol + 2 g/100 mL fructose) glycosidase activity, which, however, was inhibited by glu cose at all investigated concentrations. Furthermore, the responses of the enzyme activities were strain-dependent. In the model wine environment, only 9.805%-32.331% of glycosidase activity remained. In conclusion, SD-1f displayed the highest glycosidase activity among all selected strains.

wine; Oenococcus oeni; glycosidase activity

Q93-3

A

1002-6630（2014）23-0144-07

10.7506/spkx1002-6630-201423029

2013-11-20

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B07）； 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（2109021104）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（葡萄）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（nycytx-30-ch-03）

喬慧（1987—），女，碩士研究生，研究方向為釀酒微生物。E-mail：qiaohui9163@163.com

*通信作者：劉樹文（1965—），男，教授，博士，研究方向為葡萄釀酒微生物。E-mail：liushuwen@nwsuaf.edu.cn