李元召，孫俊良，梁新紅，張永帥

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

重組枯草芽孢桿菌PaE菌株的構(gòu)建及碳代謝阻遏效應(yīng)研究

李元召，孫俊良*，梁新紅，張永帥

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

通過基因重組的方法，將枯草芽孢桿菌168的α-淀粉酶基因amyE（除掉啟動子）整合在Paxo1質(zhì)粒上，然后將重組表達質(zhì)粒Paxo1-amyE導(dǎo)入枯草芽孢桿菌168菌株基因組中的半乳糖苷酶基因lacZ位點。通過轉(zhuǎn)化篩選和重組基因分析，獲得含有重組α-淀粉酶基因的工程菌株P(guān)aE。經(jīng)過添加4 種不同的碳源發(fā)酵實驗檢測，在外加2 g/100 mL木糖誘導(dǎo)的情況下，重組菌株的α-淀粉酶產(chǎn)量均有增加。而且重組菌 株在一定程度上能夠 克服葡萄糖等還原性糖引起的碳代謝阻遏現(xiàn)象，提高了α-淀粉酶產(chǎn)量。

α-淀粉酶；枯草芽孢桿菌；基因重組；木糖

α-淀粉酶，即α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶（α-1,4-glucan-glucan hydrolase）EC 3.2.1.1，是一種內(nèi)切酶，它能水解淀粉分子中的α-1,4糖苷鍵，將其隨 機切成長短不一的短鏈糊精和低分子 質(zhì)量糖類[1]。α-淀粉酶是一種十分重要的酶制劑，它被大量應(yīng)用于糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中，占了整個酶制劑市場份額的四分之一[2]，具有很好的應(yīng)用前景。

目前自然界中存在的野生型菌株產(chǎn)中溫α-淀粉酶的能力很低，在工業(yè)化生產(chǎn)所使用的菌株大多是由野生菌株經(jīng)過誘變得到的突變株。但是，菌株的誘變育種存在周期長、工作量大等缺點，所以利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建有效的突變體就成為了獲得高產(chǎn)菌株的有效途徑[3-4]。

發(fā)酵底物中葡萄糖等還原性糖的存在會對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生阻遏現(xiàn)象。Schumacher等[5]對調(diào)節(jié)碳代謝阻遏的調(diào)控機制進行了簡單的報道，但對淀粉酶的代謝調(diào)控并未給出明確的解釋。謝光蓉等[6]利用基因重組方法成功構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌能夠高效分泌中溫α-淀粉酶，這為淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。因此本實驗利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建一株含有木糖啟動子的重組枯草芽孢桿菌[7]，由于該表達系統(tǒng)包含木糖操縱子元件，木糖誘導(dǎo)下可以增強Paxo1質(zhì)粒中xylR基因的表達[8]。本實驗中構(gòu)建的重組菌株能夠在一定程度上緩解發(fā)酵液中還原性糖對發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生阻遏的現(xiàn)象，同時為后續(xù)研究枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶中碳代謝阻遏現(xiàn)象分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）168模式菌株購自中國工業(yè)微生物菌種管理保藏中心；整合質(zhì)粒Paxo1來源于河南科技學(xué)院食品學(xué)院微生物實驗室冷藏保存。

1.1.2 酶和試劑

Taq DNA聚合酶、細菌基因組提取試劑盒、DNA凝膠試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒DNA小劑量制備試劑盒（離心柱型） 上海捷瑞生物工程有限公司；dNTP、Prime STAR HS DNA Polymerase、核酸限制性內(nèi)切酶NotⅠ、SacⅠ、分子質(zhì)量標準（2 000 bp和500～12 000 bp）、T4 DNA連接酶 日本TaKaRa公司；氨芐青霉素（Amp）、紅霉素（erm） 美國Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Bio-Rad電轉(zhuǎn)化儀、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 北京市六一儀器廠；D-37520高速冷凍離心機 德國Sigma公司；T-Gradient PCR熱循環(huán)儀 德國Biometra公司；WFJ 7200紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；GeIX1650凝膠圖像分析系統(tǒng) 上海歐翔科學(xué)儀器有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 5 g/L，磁力攪拌器攪拌均勻后分裝50 mL培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中高壓滅菌處理。LB固體培養(yǎng)基：向液體培養(yǎng)基中添加2 g/100 mL瓊脂高壓滅菌后冷卻后使用。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米粉20、黃豆餅粉15、氯化鈣0.2、硫酸鎂0.2、磷酸氫二鉀2、檸檬酸鈉2、硫酸銨0.75、磷酸氫二鈉2。調(diào)節(jié)pH值至7.0后分裝20 mL于100 mL三角瓶中高壓滅菌處理?？莶菅挎邨U菌感受態(tài)相關(guān)培養(yǎng)基GM：LB+0.5 mol/L山梨醇，ETM：0.5 mol/L山梨醇+0.5 mol/L甘露醇+10%甘油，RM：LB+0.5 mol/L山梨醇+ 0.38 mol/L甘露醇。

1.2 方法

1.2.1 α-淀粉酶基因（amyE）的克隆以及重組質(zhì)粒Paxo1-amyE的構(gòu)建

按照GenBank上提供的枯草芽孢桿菌α-淀粉酶基因序列設(shè)計引物，其中上游引物為P1：5’-CATGGATC CATGTTTGCAAAACGATTCAA-3’，下游引物序列為P2：5’-CATGCGGCCGCTCAATGGGGAAGAGAAT-3’。其中在P1中引入NotⅠ酶切位點，在P2中引入HindⅢ酶切位點。利用細菌基因組提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，以該基因組為模板，采用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)擴增amyE基因序列。PCR擴增體系：5×Prime STAR Buffer 10.0 μL，dNTP mixture 4.0 μL，P1 1.0 μL，P2 1.0 μL，Primer STAR HS DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 32.5 μL，DNA模板1 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，28 個循環(huán)數(shù)。將PCR產(chǎn)物用NotⅠ和HindⅢ雙酶切，Paxo1質(zhì)粒用NotⅠ和SacⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α中，在含有100 μg/mL的氨芐青霉素（Amp）抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子并加以驗證。其中利用Primer 5.0軟件設(shè)計驗證引物，上游引物P3：5’-GCAAAGTCCCCCTGTTACGA-3’，下游引物P4：5’-TGAACAATCCAAAAGCGGGC-3’。相關(guān)基因操作技術(shù)參考文獻[9-10]。

1.2.2 枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備

采用Xue Gangping等[11]方法，挑取新鮮固體LB平板中的枯草芽孢桿菌單菌落接種于5 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、190 r/min過夜培養(yǎng)，測定管內(nèi)OD600nm值，控制好接種量使得接種后的培養(yǎng)基OD600nm值在0.1～0.25之間，培養(yǎng)基為50 mL的GM。然后37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm值約為1.0（大約3～4 h），用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液ETM洗滌菌體，4 ℃、5 000 r/min離心8 min去上清液，如此反復(fù)4 次。將洗滌后的菌體重懸于500 μL的ETM中，每支1.5 mL離心管分裝60 μL，置于－80 ℃保存。

1.2.3 重組枯草芽孢桿菌α-淀粉酶工程菌株構(gòu)建及陽性克隆篩選

以枯草芽孢桿菌168菌株作為宿主，將6 μL的質(zhì)粒Paxo1采用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入，在含有50 μg/mL的紅霉素（erm）的固體LB培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng)篩選，將獲得陽性克隆。用無菌牙簽挑取單克隆均勻點種在無抗生素壓力的含有2 g/100 mL可溶性固體LB平板上，同時點種原始菌株做空白。37 ℃培養(yǎng)48 h后或?qū)⑵桨宸旁? ℃培養(yǎng)72 h，迅速將平板置于3 7 ℃水浴環(huán)境保溫10 min，用碘-碘化鉀（I2-KI）溶液浸泡0.5 h，測量淀粉水解圈與菌落直徑的比值[12]。

1.2.4 重組枯草芽孢桿菌α-淀粉酶的酶活力[13]

從平板上篩選水解圈最大的菌落轉(zhuǎn)接于20 mL的LB培養(yǎng)基中過夜活化。然后按2%的接種量接種于100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中碳源分別用葡萄糖、糖原、麥芽糊精和可溶性淀粉。37 ℃、210 r/min發(fā)酵培養(yǎng)72 h，期間在培養(yǎng)12 h后添加2 g/100 mL木糖誘導(dǎo)，每隔6 h取樣離心留上清液，進行活性測定。

淀粉標準曲線繪制：分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L的可溶性淀粉溶液，分別準確量取1 mL于10 支試管中，每支試管加入5 mL的稀碘液，測定OD660nm，以O(shè)D660nm為橫坐標、淀粉質(zhì)量濃度為縱坐標得標準曲線y=1.428 3x－0.093 5（R2=0.999 5）。

酶活力測定的反應(yīng)體系：取10 mL試管，依次加入4 mL 2 g/100 mL可溶性淀粉溶液，1 mL pH 6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，60 ℃條件下預(yù)熱5 min。然后加入稀釋過的200 μL酶液，混勻，60 ℃準確保溫5 min。加入1 mL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)后放在冰上。吸取1 mL混合反應(yīng)液與5 mL稀碘液顯色，測定OD660nm，以蒸餾水代替酶液測定的結(jié)果作為對照。計算酶活力，所得的結(jié)果保留整數(shù)。

式中：ΔOD660nm為對照液的光密度值減去反應(yīng)液的光密度值；X為樣品的酶活力/（U/mL）；n為樣品的稀釋倍數(shù)；K為1.428 3；0.062為混合反應(yīng)液總體積/L；5為反應(yīng)時間/min；0.2為反應(yīng)的酶液量/mL；60為時間/min。

酶活力單位定義：1 mL液體酶于60 ℃、pH 6.0條件下，1 h液化1 g可溶性淀粉為一個活力單位，用U/mL表示。

1.2.5 重組枯草芽孢桿菌PaE蛋白的活性電泳分析[14-15]

取發(fā)酵培養(yǎng)48、60、72 h的重組枯草芽孢桿菌PaE分泌的淀粉酶初純化后分別進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳和PAGE凝膠電泳。其中10%分離膠，5%濃縮膠，電泳結(jié)束后固定、染色和脫色后將膠片置于凝膠圖像分析系統(tǒng)中照相，分析蛋白表達量的差異性。

1.2.6 發(fā)酵底物中不同碳源對重組枯草芽孢桿菌PaE分泌α-淀粉酶活力的影響[16]

在發(fā)酵培養(yǎng)的過程中利用麥芽糊精、糖原、葡萄糖和可溶性淀粉作為碳源。發(fā)酵培養(yǎng)12 h后添加2 g/100 mL木糖進行誘導(dǎo)，發(fā)酵72 h后測定淀粉酶活力，以不加木糖的發(fā)酵培養(yǎng)液為空白，來檢測重組枯草芽孢桿菌PaE菌株是否在一定程度上克服了代謝阻遏現(xiàn)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-淀粉酶基因的克隆以及重組表達載體PaE的構(gòu)建

以枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板，PCR擴增獲得amyE基因，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證結(jié)果見圖1。將PCR擴增獲得的amyE基因和枯草芽孢桿菌整合質(zhì)粒Paxo1經(jīng)過相同的雙酶切后連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組質(zhì)粒Paxo1-amyE，該質(zhì)粒的酶切驗證及電泳圖譜見圖2、3。將測序報告中提供的amyE基因序列與GenBank枯草芽孢桿菌α-淀粉酶基因序列對比，序列的同源性為98%，基本一致。

圖1 枯草芽孢桿菌α--淀粉酶（aammyyEE）基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of α-amylase gene amyE

圖2 重組表達質(zhì)粒Paxo1-amyE酶切產(chǎn)物凝膠電泳驗證圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis for digested products of plasmid Paxo1 and amyE gene

圖3 重組表達載體PaE利用PCR產(chǎn)物凝膠電泳驗證圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR product of plasmid PaE

2.2 重組枯草芽孢桿菌高效分泌表達α-淀粉酶基因工程菌篩選

圖4 含有2 g/100 mL可溶性淀粉固體發(fā)酵培養(yǎng)基水解圈篩選Fig.4 Hydrolysis circle screening on solid fermentation medium containing 2 g/100 mL soluble starch

將重組表達質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入枯草芽孢桿菌模式菌株 168感受態(tài)細胞中，由于重組質(zhì)粒中含有紅霉素抗性基因片段，經(jīng)過紅霉素抗性平板篩選后可以得到正確重組菌株。挑取正確的單克隆轉(zhuǎn)接于含有2.0 g/100 mL淀粉的固體LB平板上進行后擴大培養(yǎng)，以野生型菌株作為對比，37 ℃培養(yǎng)48 h后，滴加I2-IK溶液，直到明顯的淀粉水解圈出現(xiàn)（圖4）。用水解圈面積與菌落面積之比進行菌株產(chǎn)酶高低的粗篩。

在蛋白分離膠中加入10 g/100 mL的可溶性淀粉，最終質(zhì)量濃度為1 g/100 mL，經(jīng)過α-淀粉酶的SDS-starch-PAGE活性電泳檢測[17]，即條帶的明亮程度反映了淀粉的分解程度。重組菌株蛋白表達量明顯高于野生型（圖5），這為篩選高效分泌表達α-淀粉酶菌株提供了進一步有力的依據(jù)。

圖5 枯草芽孢桿菌產(chǎn)α-淀粉酶活性PAGE凝膠電泳圖Fig.5 PAGE of α-amylase from recombinant and wild strains

2.3 重組枯草芽孢桿菌PaE菌株重組蛋白的SDS-PAGE分析

采用DEAE-52陰離子交換柱（2 cm×20 cm）對重組枯草芽孢桿菌PaE分泌的α-淀粉酶進行分離純化。具體操作方法：采用10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（含2 mmol/L CaCl2，pH 8.4）進行平衡，上樣后使用含有0～1 mol/L NaCl的同樣緩沖液進行梯度洗脫。收集各組分并測定其在280 nm波長處的光密度值，將同一個峰組分合并透析脫鹽后進行活性測定。電泳結(jié)果（圖6）顯示約在58 kD處有明顯的目的蛋白質(zhì)條帶，和理論分子質(zhì)量大小基本一致。木糖誘導(dǎo)72 h后α-淀粉酶的表達量較大。

圖6 重組枯草芽孢桿菌PaE菌株不同培養(yǎng)時間的α--淀粉酶SDS-PAGE電泳Fig.6 SDS-PAGE of α-amylase from PaE strain at different culture time points

2.4 發(fā)酵底物中不同碳源對重組枯草芽孢桿菌PaE菌株產(chǎn)α-淀粉酶的影響

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)12 h后添加2 g/100 mL木糖誘導(dǎo)，37℃、210 r/min培養(yǎng)72 h后取發(fā)酵上清液初純化后進行酶活力測定。經(jīng)過3 次平行測定后含有麥芽糊精、可溶性淀粉、糖原、葡萄糖和空白對照的發(fā)酵搖瓶中測定的平均酶活力依次為（749±23）、（326±18）、（710±12）、（332±13）U/mL和（104±8）U/mL。未經(jīng)過木糖誘導(dǎo)的野生型菌株酶活力依次為（620±4）、（277±9）、（474±5）、（71±6）U/mL和（125±4） U/mL，利用SPSS Statistics 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性方差分析，兩者有顯著性差異（P＜0.05）。

圖7 不同碳源和添加木糖誘后對重組菌株P(guān)aE產(chǎn)α-淀粉酶活力的影響Fig.7 Effects of xylose combined with other carbon sourceson the α-amylase activity of the recombinant strain

由圖7可知，在含有4 種不同碳源的發(fā)酵液中重組菌株經(jīng)2 g/100 mL木糖誘導(dǎo)后淀粉酶的表達量均有所增加。麥芽糊精和糖原作為碳源發(fā)酵產(chǎn)酶量要優(yōu)于其他2 種碳源，產(chǎn)酶量分別增加了129 U/mL和236 U/mL。在含有葡萄糖的發(fā)酵液中，PaE菌株的酶活力由71 U/mL增加到了332 U/mL。結(jié)果顯示PaE菌株能夠在一定程度上緩解碳代謝阻遏現(xiàn)象，這對工業(yè)發(fā)酵提供了一定的理論支持。實驗中僅選取了4 種不同碳源，其他碳源的影響還需要進一步的研究。

3 討 論

由于葡萄糖是很多原核微生物生長優(yōu)先利用的碳源，其分解代謝產(chǎn)物會對許多基因的表達產(chǎn)物產(chǎn)生阻遏或激活作用，往往引起復(fù)雜的生理效應(yīng)[17]。也會阻遏某些酶（特別是參與分解代謝的酶）生物合成的現(xiàn)象，稱為分解代謝物阻遏作用（carbon catabolite repression，CCR）。葡萄糖等還原性糖所引起的阻遏效應(yīng)在枯草芽孢桿菌中已經(jīng)被廣泛研究[18-19]。

應(yīng)明等[20]利用基因敲除的方法構(gòu)建ccpA（碳代謝阻遏調(diào)控基因）基因缺失的枯草芽孢突變體菌株，很大程度上緩解了此現(xiàn)象，并且使得在10 g/100 mL還原性糖存在的條件下發(fā)酵產(chǎn)物核黃素提高了95%。借鑒他人的研究，實驗從另一個角度利用基因重組的方法構(gòu)建了重組菌株P(guān)aE。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵實驗，在4 g/100 mL葡萄糖存在的條件下，α-淀粉酶酶活力從71 U/mL增加到了332 U/mL。很大程度上緩解了碳代謝阻遏現(xiàn)象，這為后續(xù)的進一步研究提供了理論依據(jù)。

本實驗中發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌發(fā)酵利用麥芽糊精和糖原產(chǎn)生α-淀粉酶的酶活力要高于可溶性淀粉和葡萄糖。雖然在木糖誘導(dǎo)條件下，酶活力均有一定的提高，但是考慮實際生產(chǎn)成本和經(jīng)濟效益，還是選擇麥芽糊精進行進一步的研究。實驗中僅選取了4 種不同碳源，而對于其他碳源的影響還需要繼續(xù)不斷的探究。

去除掉啟動子α-淀粉酶基因amyE在枯草芽孢桿菌中整合表達，與單純的質(zhì)粒所攜帶的基因表達相比較，整合表達具有相對的基因穩(wěn)定性，不容易發(fā)生基因片段的丟失，菌種本身的退化等原因造成的表達水平降低等現(xiàn)象。這同時也為淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)提供了一定的研究基礎(chǔ)。

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Construction and Carbon Catabolite Repression of Recombinant Bacillus subtilis PaE

LI Yuan-zhao, SUN Jun-liang*, LIANG Xin-hong, ZHANG Yong-shuai
(School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

Using gene recombination method, the alpha amylase gene amyE (without promoter) of Bacillus subtilis was integrated into Paxo1 plasmid and the galactosidase gene lacZ of B. subtilis strain 168 was introduced into the recombinant expression plasmid Paxo1-amyE. After transformation and screening analysis, genetically engineered strain PaE containing the recombinant alpha amylase gene was selected. With the addition of four different carbon sources, the alpha amylase production by the recombinant strain was promoted under the induction of 2 g/100 mL xylose. In addition, the recombinant strain could overcome the carbon catabolic repression caused by reducing saccharides such as glucose to a certain extent to improve the yield of alpha amylase.

α-amylase; Bacillus subtilis; genetic recombination; xylose

Q789

A

1002-6630（2014）23-0134-05

10.7506/spkx1002-6630-201423027

2013-11-26

國家自然科學(xué)基金面上項目（311641/C200101）；河南省科技計劃項目（122102110037）

李元召（1986—），男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：751583202@163.com

*通信作者：孫俊良（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：sjl338@163.com