胡園園，郭 輝，錢俊青

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

應(yīng)用前沿親和色譜 評價5 種知母糖苷類化合物的α-淀粉酶抑制活性

胡園園，郭 輝，錢俊青*

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

以硅膠為載體，制備α-淀粉酶親和色譜柱，以線掃循環(huán)伏安法為檢測方法，評價知母提取物的α-淀粉酶抑制活性。首先考察固定化條件對固定化酶的影響以及親和色譜柱的穩(wěn)定性。其次利用前沿親和色譜檢測5 種知母糖苷類化合物（新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅡ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ）的α-淀粉酶親和力。最后檢測化合物的α-淀粉酶抑制活性。結(jié)果表明5 種化合物的α-淀粉酶結(jié)合力大小排序為：新芒果苷（Kd=0.230 5 μmol/L）＞芒果苷（Kd=0.299 5 μmol/L）＞知母皂苷BⅡ（Kd=0.312 4 μmol/L）＞知母皂苷BⅢ （Kd=0.316 2 μmol/L）＞知母皂苷AⅡ（Kd=0.453 3 μmol/L），其排序結(jié)果與樣品的α-淀粉酶抑制活性一致。說明前沿親和色譜可以用來定量檢測化合物的α-淀粉酶抑制活性，且可根據(jù)親和力的大小將化合物的抑制活性進行排序。

前沿親和色譜；線掃循環(huán)伏安法；固定化α-淀粉酶；α-淀粉酶抑制活性；知母

α-淀粉酶抑制活性可以用來評價化合物的降糖活性[1]，以α-淀粉酶為標(biāo)靶制備親和色譜柱，可以提高降糖藥物的篩選效率[2]。前沿親和色譜（frontal affinity chromatography，F(xiàn)AC）[3-4]通過將標(biāo)靶分子固定在載體上制備親和色譜柱，待測樣品溶液通過親和色譜柱，樣品溶液中與固定化分子有生物親和性的化合物就會與固定化分子結(jié)合，使其流出滯后，流出體積增大。親和力越大的化合物，結(jié)合力越大，流出體積就越大，通過合適的檢測器就可得相應(yīng)的流出曲線，并計算得出解離常數(shù)Kd[5]。目前這種方法已經(jīng)被廣泛用來定量分析受體-配體[6-7]，酶-底物和酶-抑制劑[8]等。本實驗采用硅膠吸附[9]固定化α-淀粉酶，其條件 溫和，對酶的穩(wěn)定性和活性影響小[10]。

前沿親和色譜的檢測方法有很多種，根據(jù)化合物的特性及檢測目的不同可靈活選擇不同的檢測器。紫外檢測器操作簡便、成本低，適用于已知的、有紫外吸收特性的化合物的Kd的檢測。質(zhì)譜檢測器[3]成本高、操作復(fù)雜，但可用于未知化合物的Kd值的檢測及其化學(xué)結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點的確定。極譜檢測[11-12]方法簡單、靈敏度高、快速準(zhǔn)確、選擇性好、應(yīng)用范圍廣，可用于紫外可見光波長范圍內(nèi)吸收弱或者沒有紫外吸收的化合物的Kd值檢測[13]。本實驗待檢測樣品新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅡ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ為知母提取物，其中3 個知母皂苷類的化合物紫外吸收弱，但是有電化學(xué)活性基團（碳碳共軛雙鍵、羰基、羥基等），所以選擇極譜分析儀作為檢測器。本實驗將前沿親和色譜與線掃循環(huán)伏安法結(jié)合用來定量分析分子間親和力，它可以作為親和色譜紫外檢測的一種補充，擴大親和色譜篩選應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅡ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ，由浙江工業(yè)大學(xué)生藥學(xué)實驗室提供，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測純度大于97%。

硅膠（100～200 目） 青島海洋化工廠分廠；3,5-二硝基水楊酸、石墨粉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；α-淀粉酶（豬胰蛋白酶） 上海楷洋生物技術(shù)有限公司；阿卡波糖（50 mg/片） 拜耳醫(yī)藥保健公司；可溶性淀粉 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉、酒石酸鉀鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JP-303極譜分析儀 成都儀器廠；工作電極為石墨電極、參比電極為飽和Ag-AgCl電極、對電極為鉑片電極 天津蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHA-BA水浴恒溫振蕩器 上海榮華儀器有限公司；HIMAC CR21GII 高速冷凍離心機 日本日立工機株式會社。

1.3 方法

1.3.1 α-淀粉酶固定化

α-淀粉酶固定化方法采用物理吸附法[9]，準(zhǔn)確稱取1.5 g硅膠，加入15 mL α-淀粉酶（10 mg/mL）溶液，密封于37 ℃水浴170 r/min振蕩12 h。離心分離，用緩沖液洗滌固體，再離心分離，如此反復(fù)至洗滌液在280 nm波長處檢測不到吸收值為止，檢測固定化酶的表觀酶活力和固定化蛋白含量。

1.3.2 固定化α-淀粉酶活力測定

固定化α-淀粉酶酶活力測定參照Bernfeld法[14]。取20 μL固定化酶（0.1 mg/mL）溶液與200 μL的磷酸緩沖液（pH 7.0）混合放入5 mL容量瓶中，置于60 ℃恒溫水浴振蕩10 min，然后加入200 μL 1%淀粉溶液準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，然后加入200 μL 3,5-二硝基水楊酸，在沸水浴中加熱煮沸10 min停止反應(yīng)，流水冷卻，定容到5 mL，搖勻后于520 nm波長處測定吸光度。同時設(shè)置空白對照組，以麥芽糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線測出酶活力。

固定化α-淀粉酶活力單位定義為：在上述條件下α-淀粉酶每分鐘水解生成1 μmol麥芽糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

固定化表觀酶活力測定：固定化的硅膠用緩沖溶液沖洗，直至洗脫液在280 nm波長處無吸收值，測定固定化硅膠的α-淀粉酶酶活力，按照公式（1）計算固定化表觀酶活力回收率。

1.3.3 固定化蛋白含量測定方法

參照Bradford 法[15-16]，0.1 mL蛋白洗脫液加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，2 min內(nèi)，在595 nm波長處檢測，記錄吸光度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線計算蛋白含量，并按照公式（2）計算酶固定化率。

1.3.4 α-淀粉酶抑制活性的測定方法

α-淀粉酶抑制活性的測定方法參照Bernfeld法[17]，樣品先用少量二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，然后用重蒸水稀釋到相應(yīng)的濃度，以1%可溶性淀粉為底物，測定了這5 種化合物對α-淀粉酶的抑制活性，以Acarbose半抑制濃度（IC50）為陽性對照。

1.3.5 前沿親和色譜-線掃循環(huán)伏安法檢測樣品與α-淀粉酶的親和力

親和色譜柱的制備：將固定化硅膠用濕法裝柱填充到層析柱（20 cm×0.5 cm）中，邊裝柱邊敲，使硅膠填充緊密。用0.05 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）沖洗柱子，直至出現(xiàn)緩沖溶液峰。

檢測池為兩邊不等高的U型圓柱型腔室，在短端上連接一個獨立腔室，中間放置兩層環(huán)形硅膠環(huán)，加強密封效果，硅膠墊中間夾入一層磺化聚砜膜（使用前在1.0×10－2mol/L的H2SO4中浸泡8 h以上，使用前用超純水洗凈），以1.0×10－3mol/L的KCl為電解質(zhì)[18]。

樣品溶液配制成幾個不同的濃度。進樣之前，先對樣品溶液進行CV掃描，掃描速率100 mV/s，找出最佳掃描電壓范圍。然后在最佳電壓掃描范圍內(nèi)，將樣品溶液加在親和硅膠色譜柱上，記錄開始時間、流速，直到出現(xiàn)樣品溶液峰，記錄結(jié)束時間。在一個樣品檢測結(jié)束后，通入淋洗液，吸收峰再次平衡后，可以進行下一個樣品的檢測。

苯酚的流出體積（V0）作為空白對照，0.01 mg/mL苯酚溶液的流出體積為0.4 mL，阿卡波糖為陽性對照。各樣品先溶于少量DMSO溶液中，然后用雙蒸水配制成不同濃度后通入親和色譜柱，通過極譜分析儀，得到各濃度樣品的流出體積，計算酶與樣品的解離常數(shù)Kd。

1.3.6 前沿親和力計算方法

根據(jù)前沿親和色譜理論，前沿親和色譜的基本平衡方程為式（3）[5]。

式中：Kd為A、B分子的解離常數(shù)/（μmol/L）；A為待測化合物；B為固定化酶；[A]0是待測化合物A進入親和柱中的初始濃度/（μmol/L）；Bt是親和色譜柱中固定化酶量/nmol；V為化合物A的洗脫體積/mL；V0為死體積/mL。

為了求得A、B分子的解離常數(shù)Kd，可將方程（3）變形后得到下式（4）。

1.3.7 親和色譜柱的穩(wěn)定性評價

將質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的芒果苷重復(fù)進樣，檢測α-淀粉酶親和色譜柱的使用穩(wěn)定性，包括日內(nèi)重復(fù)使用穩(wěn)定性和日間的重復(fù)使用穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅膠吸附固定α-淀粉酶的工藝優(yōu)化

不同固定化條件對固定化酶的影響很大。由表1可知，加酶量影響載體上固定化酶的量。隨著加酶量的增加，表觀酶活力回收率和酶固定化率也增加，當(dāng)加酶量為150 mg時，表觀酶活力回收率為（63.44±0.04）%，酶固定化率為（59.96±0.03）%，都達(dá)到了最佳值。這是因為在一定數(shù)量的載體基團的條件下，溶液中游離酶量越多，能固定上去的酶也越多，酶固定化率越高。當(dāng)游離酶量與載體可吸附基團平衡時，繼續(xù)增加酶量，空間位阻增大，影響游離酶與活性基團的吸附，使表觀酶活力回收率和酶固定化率降低。

表1 不同固定化條件對固定化酶的影響Table1 Effect of different immobilization conditions on the immobilized enzyme

pH值影響游離酶的活性，對酶的活性中心的形成有重要作用。不同pH值環(huán)境對酶的固定化影響也很大，在最適pH 7.0的磷酸緩沖液中，酶的表觀酶活力回收率（66.87±0.03）%和酶固定化率（66.21±0.05）%都到了最大值，偏酸或偏堿都不利于酶的固定化。吸附溫度、吸附時間也會影響酶的表觀酶活力回收率和酶固定化率，由表1可知，最佳吸附溫度和最佳吸附時間分別是40 ℃和12 h。1.5 g硅膠加入15 mL α-淀粉酶（10 mg/mL）溶液中（pH 7.0的磷酸鹽緩沖液溶解）在40 ℃的恒溫水浴鍋中170 r/min吸附12 h，表觀酶活力回 收率和酶固定化率分別為（81.02±0.06）%和（67.45±0.01）%。

2.2 親和色譜柱的穩(wěn)定性

表2 親和色譜柱的日內(nèi)重復(fù)使用性Table2 Repeatability of the affinity column performed in one day

表2是在同一根親和色譜柱上一天內(nèi)連續(xù)進樣5 次所得突破體積（V－V0），由表2可知，連續(xù)5 次進樣的平均突破體積為0.59 mL，其日內(nèi)重復(fù)性非常好（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）＜3%）。

表3 親和色譜柱的日間重復(fù)使用性Table3 Reproducibility of the affinity column performed in 5 days

表3為親和色譜柱的日間的重復(fù)使用穩(wěn)定性，在同一根親和色譜柱上連續(xù)5 d每天進樣1 次測其流出曲線，5 d的平均突破體積為0.60 mL，日間重復(fù)性的RSD為6.79%。結(jié)果表明，隨著使用時間的延長，其重現(xiàn)性有所下降。但在4 d內(nèi)其RSD＜5%，從而得知親和色譜柱可 以重復(fù)使用4 d左右。

2.3 前沿親和色譜-線掃循環(huán)伏安法檢測樣品與α-淀粉酶的親和力

表4 樣品前沿親和色譜的Kd值Table4 Determination of kd for samples in the affinity column

由表4可知，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅡ的Kd值分別是0.230 5、0.299 5、0.312 4、0.316 2、0.453 3 μmol/L。Kd值越小，化合物與標(biāo)靶酶的親和力越大。根據(jù)樣品化合物Kd值將化合物與α-淀粉酶的親和力排序，其結(jié)合力大小是：新芒果苷＞芒果苷＞知母皂苷BⅡ＞知母皂苷BⅢ＞知母皂苷AⅡ。

2.4 樣品的α-淀粉酶抑制活性

為了進一步確定樣品對α-淀粉酶的親和力與其對α-淀粉酶作用的關(guān)系，測定了5 種化合物的α-淀粉酶抑制活性。

表5 樣品的α-淀粉酶抑制活性Table5 a-Amylase inhibitory activity of samples

由表5可知，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅡ的IC50分別是（22.24±0.03）、（41.60±0.30）、（43.36±0.50）、（52.87±0.7）、（196.63±0.70）mg/mL。樣品的α-淀粉酶抑制活性：新芒果苷＞芒果苷＞知母皂苷BⅡ＞知母皂苷BⅢ＞知母皂苷AⅡ。

由以上結(jié)果可知化合物的α-淀粉酶結(jié)合力大小與其α-淀粉酶抑制活性呈正相關(guān)。說明前沿親和色譜-線掃循環(huán)伏安法可以用來評價天然化合物的α-淀粉酶抑制活性。

3 結(jié) 論

以硅膠為載體，制備α-淀粉酶親和色譜柱，以線掃循環(huán)伏安法為檢測方法，應(yīng)用前沿親和色譜技術(shù)評價5 種知母糖苷類化合物的α-淀粉酶抑制活性。通過定量檢測化合物與固定化酶的親和性，再根據(jù)結(jié)合力大小排序，結(jié)果表明前沿親和色譜可以用來評價化合物的抑制活性。線掃循環(huán)伏安法設(shè)備價廉，操作簡便，靈敏度高可用于紫外吸收弱或沒有紫外吸收的化合物的檢測，將前沿親和色譜與線掃循環(huán)伏安法聯(lián)用擴大了前沿親和色譜的應(yīng)用范圍。為了使前沿親和色譜技術(shù)更好地應(yīng)用于天然化合物的篩選，要不斷地豐富和完善親和色譜柱的制備和檢測器的運用。

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Application of Frontal Affinity Chromatography for Evaluating α-Amylase Inhibitory Activity of Five Glycoside Compounds Extracted from Rhizoma anemarrhenae

HU Yuan-yuan, GUO Hui, QIAN Jun-qing*
(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Silica gel was used as the carrier to prepare α-amylase affinity chromatography column. The column was then used for evaluating the α-amylase inhibitory activity of five glycoside compounds (neomangiferin, mangiferin, timosaponin AⅡ, timosaponin BⅡ, and timosaponin BⅢ) from Rhizoma anemarrhenae by linear scan cyclic voltammetry. The effect of immobilization conditions on the immobilized enzyme and the stability of the affinity chromatography column were investigated. Frontal affinity chromatography was applied to explore the binding affinity of these five glycoside compounds to α-amylase. Finally, the α-amylase inhibitory activity of samples was assayed. Results showed that the α-amylase binding affinity of the glycosides followed the decreasing order: neomangiferin (Kd= 0.230 5 μmol/L) ＞ mangiferin (Kd= 0.299 5 μmol/L) ＞ timosaponin BⅡ (Kd= 0.312 4 μmol/L) ＞ timosaponin BⅢ (Kd= 0.316 2 μmol/L) ＞ timosaponin AⅡ (Kd= 0.453 3 μmol/L). The same ranking was observed for α-amylase inhibitory activity. Therefore, frontal affinity chromatography can be used to quantitatively detect the α-amylase inhibitory activity of five glycoside compounds and the α-amylase inhibitory activity follows the same order as the binding affinity.

frontal affinity chromatography; linear scan cyclic voltammetry; α-amylase immobilization; α-amylase inhibitory activity; Rhizoma anemarrhenae

R932

A

1002-6630（2014）23-0099-05

10.7506/spkx1002-6630-201423020

2014-02-21

浙江省科技創(chuàng)新團隊重大科技項目（2010R50032）

胡園園（1988—），女，碩士研究生，主要從事前沿親和色譜篩選中藥降糖藥研究。E-mail：zhiyao0701@163.com

*通信作者：錢俊青（1964—），男，教授，博士，主要從事天然藥物分離研究。E-mail：pharmo@163.com