李朋亮，廖若宇，王 旭，龔 媛，劉敦華

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

枸杞曬干過程中黃酮類化合物和苯丙氨酸解氨酶活性的變化

李朋亮，廖若宇，王 旭，龔 媛，劉敦華*

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

本實驗在枸杞表面涂抹Na2CO3、Na2SO3溶液作為除蠟劑，以不涂抹除蠟劑為空白對照，研究曬干過程中總黃酮和苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活性的變化，并利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測枸杞中山奈酚、蘆丁和槲皮素含量的變化。對總黃酮含量和PAL活性、3種不同處理方式條件下3 種黃酮類化合物含量之間進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：Na2CO3、Na2SO3和空白對照處理下的枸杞在曬干過程中PAL活性、總黃酮含量呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，山奈酚、蘆丁和槲皮素含量均呈現(xiàn)先增加后下降趨勢；同一處理下的PAL活性和總黃酮含量變化呈顯著極強(qiáng)正相關(guān)，山奈酚、蘆丁和槲皮素含量變化呈正相關(guān)；除蠟劑影響同一干燥時間下PAL活性、總黃酮、山奈酚、蘆丁和槲皮素含量的大小，并且其達(dá)到最高值的時間也受除蠟劑的影響。

枸杞；黃酮類化合物；苯丙氨酸解氨酶； 曬干；山奈酚；蘆??；槲皮素

黃酮類化合物（flavonoid）是一大類植物次級代謝產(chǎn)物，具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，包括黃酮醇、黃酮、黃烷酮、黃烷醇、花青素和異黃酮等，具有消炎、抗癌、清除自由基、止咳、平喘、祛痰之功效，并能擴(kuò)張冠狀動脈及降低膽固醇，有增強(qiáng)心臟收縮、減少心臟搏動數(shù)及明顯的抗 氧化等作用[1-2]。黃酮類化合物前體物質(zhì)來自于莽草酸途經(jīng)的L-苯丙氨酸（L-phenylalanine），經(jīng)苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）催化合成肉桂酸（cinnamate），再經(jīng)過肉桂酸4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）形成對香豆酸（p-coumaric acid），再經(jīng)過一系列反應(yīng)合成各種酚酸類物質(zhì)和黃酮類化合物，其中PAL是黃酮類化合物合成的關(guān)鍵酶和限速酶[3-4]。趙則海等[5]研究了攀援型和矮生型四棱豆在遭受干旱時苯丙氨酸解氨酶活性和黃酮含量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PAL活性與總黃酮之間存在顯著的正相關(guān)。

枸杞（Lycium barbarum L.）作為中國傳統(tǒng)的中草藥在幾個世紀(jì)前已被廣泛用于功能性食品的原料，經(jīng)研究枸杞含有大量多糖、黃酮類化合物和類胡蘿卜素等功能性成分，這也使枸杞具有抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和增強(qiáng)免疫力等功能[6-7]。枸杞中含有豐富的黃酮類化合物，Inbaraj等[1]利用HPLC-DAD-ESI-MS對枸杞中的黃酮類化合物進(jìn)行了檢測，得出枸杞含槲皮素-鼠李糖-二己糖438.6 μg/g、蘆丁281.3 μg/g、槲皮素-二鼠李糖117.5 μg/g、山奈酚-3-O-蕓香糖苷97.7 μg/g。Wang等[8]利用內(nèi)標(biāo)法檢測了枸杞中3 種黃酮類化合物的含量，得出含有槲皮素-二糖苷66.0 μg/g、蘆丁42.0 μg/g、山奈酚-3-O-蕓香糖苷11. 3 μg/g。

枸杞鮮果不易貯藏，易發(fā)生霉變腐爛，因此枸杞經(jīng)常以干果形式在市場上銷售。枸杞干燥方式主要以曬干和烘干為主，由于枸杞果實表皮覆蓋有一層致密的蠟質(zhì)層，主要成分為長鏈脂肪烴類化合物，嚴(yán)重阻礙果實內(nèi)部水分的蒸發(fā)，使干燥時間延長[9]。為了縮短干燥時間，往往在枸杞表面涂抹堿液以除去蠟質(zhì)。傳統(tǒng)除蠟劑為Na2CO3稀溶液[10]，最近幾年為了保證枸杞在干制中的色澤鮮艷，也有用Na2SO3溶液作為除蠟劑。枸杞干燥過程中果實會不斷失水，而植物在光照、輻射、溫度變化與失水環(huán)境中，會刺激黃酮類化合物的合成[11-13]。Hernández 等[11]對地中海地區(qū)Cistus clusii葉子黃酮類化合物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素（epigallocatechin gallate）、表兒茶素（epicatechin）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate）在干旱30 d內(nèi)一直增長，直到最大值，而且他認(rèn)為植物在干旱過程中會遭受更厲害的氧化應(yīng)激才導(dǎo)致產(chǎn)生了更多的抗氧化劑；Peinado等[12]研究了葡萄在曬干中的酚類物質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)黃酮類成分在曬干中一直呈現(xiàn)上升趨勢。枸杞在曬干過程中會遭受到失水的壓力，因此會更容易遭受氧化應(yīng)激，但是對枸杞曬干中黃酮類化合物的變化尚未見報道。本實驗研究以Na2CO3和Na2SO3為除蠟劑，枸杞曬干過程中黃酮類物質(zhì)的變化，并測定了PAL的活性，通過相關(guān)性分析研究各組分之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧杞Ⅰ號枸杞（Lycium Barbarum L.）鮮果，2013年9月摘自寧夏銀川市軍馬場，選取無破損、大小、顏色均勻的枸杞，水分含量（81.14±0.47）%；甲醇（色譜純）天津市大茂化學(xué)試劑廠；蘆丁、槲皮素（純度≥98%）中國藥品生物制品檢定所；山奈酚（純度≥98%） 成都曼斯特生物科技有限公司；L-苯丙氨酸（≥98%）、β-巰基乙醇 美國Sigma公司；硼酸、硼砂、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、聚乙烯吡咯烷酮、石油醚、無水乙醇、冰乙酸均為國產(chǎn)分析純；實驗用水皆為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

HZS-HA振蕩水浴器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；P10-WS超純水機(jī) 湖南科爾頓水務(wù)有限公司；AL204分析天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Easysep-1010高效液相色譜（配有P3000A二元高壓輸液泵、UV3000紫外分光檢測器、HT-220A柱溫箱、T2100P色譜工作站） 上海通微分析技術(shù)有限公司；VenusilXBP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 上海本昂科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.001 1 g、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.000 7 g、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品0.000 6 g，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，分別對標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋100、10、5、1 倍，經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過濾后，取20 μL進(jìn)行上樣。以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照文獻(xiàn)[14-15]的方法進(jìn)行修改確定HPLC洗脫條件為：紫外波長290 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，梯度洗脫，A相為甲醇，B相為乙酸-水（1∶250，V/V）溶液；洗脫程序：0～8 min，15%～20% A；8～18 min，20%～60% A；18～25 min，60% A；25～30 min，60%～80% A；30～40 min，80% A；40～50 min，80%～15% A；50～55 min，15% A結(jié)束。得出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3.069×104+2.257×107x，R2=0.999 7；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線y=－1.484×104+5.401×107x，R2=0.999 6；山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線y=－4.424×104+5.864×107x，R2=0.999 8。

1.3.2 枸杞中黃酮類物質(zhì)含量的測定

枸杞粉碎后，按照1∶50（m/V）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液，70 ℃浸提3 次，每次2.0 h，抽濾并合并濾液，55 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，用適量石油醚脫色素，再旋轉(zhuǎn)蒸干殘余石油醚，用10 mL 80%的甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過濾后，按照1.3.1節(jié)方法進(jìn)行上樣測定。

1.3.3 曬干過程中黃酮類物質(zhì)含量的測定

按照1∶50（m/V）配制Na2CO3溶液和Na2SO3溶液作為除蠟劑，稱取鮮果5.00 g，分別浸入不同除蠟劑后迅速撈出，使鮮果枸杞表面沾有除蠟劑，以不涂抹除蠟劑為對照，于陽光下曬制，每24 h取樣，按照1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)測定枸杞中山奈酚、槲皮素和蘆丁含量，同時測定每個干燥階段下枸杞干基質(zhì)量，總黃酮含量以每克干基枸杞計。

1.3.4 曬干過程中總黃酮含量的測定

按照文獻(xiàn)[16]方法測定每個干燥階段下枸杞中總黃酮含量，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)按照每100 g干基枸杞計。

1.3.5 曬干過程中枸杞PAL活性的測定

稱取不同曬干時間2 粒枸杞的質(zhì)量（干質(zhì)量約0.2 g），加10.0 mL 0.1 mol/L硼酸緩沖液（pH 8.8，內(nèi)含1 mmol/L的EDTA，5 mmol/L β-巰基乙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%聚乙烯吡咯烷酮和體積分?jǐn)?shù)5%的甘油）與適量石英砂，冰水浴中研磨勻漿后，4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，上清液用于酶活性測定。取1.0 mL酶提取液，加1.0 mL 0. 02 mol/L L-苯丙氨酸和用0.1 mol/L硼酸緩沖液（pH 8.8）定容至10.00 mL，空白不加酶液，使用紫外可見分光光度計在290 nm波長處測OD值，40 ℃恒溫水浴60 min，測OD290nm值，以每小時每克干質(zhì)量增加0.01 OD290nm值為一個單位表示酶活力的相對大小[17-20]。將PAL活性與枸杞總黃酮含量變化，以及山奈酚、槲皮素和蘆丁含量變化之間進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞曬干過程中PAL活性的變化

圖1 枸杞曬干過程中PAL活性變化Fig. 1 Variation in PAL activity during sun-drying

如圖1所示，曬干過程中3 種處理方式（Na2CO3、Na2SO3、空白對照）下枸杞的PAL相對活力呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，但是不同處理方式下的PAL相對活力變化也稍有差異。Na2CO3處理下的枸杞前4 d中PAL相對活力由11.64上升到39.87，之后增加較為緩慢，但是第6天之后迅速增加到第8天的66.07 ；Na2SO3處理的枸杞在前4 d中PAL活性由16.23增加至45.33，之后增長速率比較緩慢；空白對照組的枸杞在PAL相對活力由開始的17.76一直增加到第8天的44.92，但是整個增長過程都比較緩慢。干燥前7 d，同一曬干時間下PAL相對活力基本表現(xiàn)為：Na2SO3處理＞Na2CO3處理＞空白對照。PAL是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，因而，干旱脅迫條件下PAL活性增加的原因可能與苯丙烷類代謝加強(qiáng)有關(guān)[20]，Na2CO3與Na2SO3處理下的枸杞在曬干中其干燥速率相差不大，但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于空白對照組的枸杞，可能迅速失水更能刺激PAL活性的增加。但是這很難解釋Na2CO3處理組曬干最后2 d，其PAL相對活力突然增長的現(xiàn)象，這可能與除蠟劑有關(guān)系，因為Na2SO3本身就具有抑制酶活性的作用。

2.2 枸杞曬干過程中總黃酮含量的變化

圖2 枸杞曬干過程中總黃酮含量變化Fig. 2 Variation in total flavonoid content during sun-drying

圖2顯示3 種處理方式下的枸杞總黃酮含量在曬干過程中持續(xù)增長。Na2CO3處理的枸杞其總黃酮含量增加最快到第5天時其總黃酮含量已經(jīng)達(dá)到0.79 g/100 g干枸杞，之后增長較為緩慢；Na2SO3處理的枸杞到第6天之后才基本趕上Na2CO3處理的枸杞，其值達(dá)到0.80 g/100 g干枸杞，之后增長較為緩慢；空白對照的總黃酮增加最緩慢，到干燥結(jié)束時，其總黃酮含量明顯小于兩種除蠟劑處理下的枸杞。干燥前期Na2CO3處理的枸杞其總黃酮含量均比Na2SO3的高，但是最終二者總黃酮含量基本達(dá)到一致。

2.3 枸杞中黃酮類化合物的HPLC圖

圖3 枸杞黃酮類化合物HPLLCC圖Fig.3 HPLC chromatograms of flavonoids from Lycium barbarum L.

由圖3a可知，蘆丁、槲皮素、山奈酚對照品的出峰時間分別為22.923、26.839、31.331 min；由圖3b可知，枸杞在22.918、26.842、31.320 min分別出現(xiàn)蘆丁、槲皮素、山奈酚，分離效果較好，其含量在曬干過程中的變化見2.4、2.5、2.6節(jié)。

2.4 枸杞曬干過程中山奈酚含量的變化

圖4 枸杞曬干過程中山奈酚含量變化Fig.4 Variation in kaempferol content during sun-drying

如圖4所示，Na2CO3處理下的枸杞在前6 d，山奈酚含量由開始的0.01 mg/g升至0.21 mg/g，之后再下降到第8天下降到0.12 mg/g；Na2SO3處理的枸杞其山奈酚由第1天的0.10 mg/g升至第3天的0.17 mg/g，然后直接下降到第8天的0.12 mg/g；空白對照的枸杞中山奈酚先由第1天的0.11 mg/g升至第3天的0.18 mg/g，然后再第4天略有下降后，升到第5天的0.21 mg/g，再下降到第8天的0.10 mg/g。曬干過程中3 種處理下的山奈酚含量變化均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，但是上升和下降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)因除蠟劑不同而不同。

2.5 枸杞曬干過程中蘆丁含量的變化

圖5 枸杞曬干過程中蘆丁含量的變化Fig.5 Variation in rutin content during sun-drying

如圖5所示，3 種處理方式下的枸杞在曬干過程中蘆丁含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化規(guī)律。Na2CO3處理的枸杞其蘆丁含量由開始的0.38 mg/g升至第6天的0.87 mg/g之后再下降到第8天的0.69 mg/g；Na2SO3處理的枸杞在前3 d其蘆丁含量由開始的0.33 mg/g增加到0.78 mg/g，再迅速降到第8天的0.26 mg/g；空白對照的枸杞中蘆丁含量先是由最初的0.13 mg/g升至第4天的0.58 mg/g，最后再下降到0.10 mg/g。Na2CO3、Na2SO3、空白對照的枸杞蘆丁含量分別在曬干第6、3、4天達(dá)到最大，并且表現(xiàn)為Na2CO3＞Na2SO3＞空白對照。

2.6 枸杞曬干過程中槲皮素含量的變化

圖6 枸杞曬干過程中槲皮素含量的變化Fig.6 Variation in quercetin content during sun-drying

如圖6所示，為3 種處理方式下枸杞中槲皮素的變化規(guī)律。Na2CO3處理下的枸杞在前6 d槲皮素由開始的0.01 mg/g升至0.11 mg/g，之后再下降到第8天的0.06 mg/g；Na2SO3處理的枸杞槲皮素由第1天的0.03 mg/g升至第3天的0.22 mg/g，之后再下降到第8天的0.03 mg/g?？瞻讓φ盏蔫坭介纹に赜傻?天的0.03 mg/g升至第4天的0.15 mg/g，之后再下降到第8天的0.03 mg/g。分別在第6、3、4天Na2CO3、Na2SO3、空白對照的枸杞槲皮素含量達(dá)到最大，表現(xiàn)為空白對照＞Na2SO3＞Na2CO3。

黃酮類化合物在干燥前期會出現(xiàn)增長，主要原因可能是曬干過程中由于枸杞受到失水脅迫刺激了黃酮類化合物的合成，后期下降可能是由于水分含量的降低，一方面使黃酮類化合物的合成受阻[20]，另一方面使枸杞更加容易遭受到氧化應(yīng)激[11]，從而會消耗大量的黃酮類化合物。

2.7 PAL活性與總黃酮含量變化的相關(guān)性分析

圖1、2顯示，PAL活性與總黃酮含量變化均有隨著曬干時間的延長而增加的趨勢，而PAL是黃酮類化合物的合成的第一個關(guān)鍵酶，對枸杞曬干過程中PAL活性與總黃酮含量變化做相關(guān)性分析，結(jié)果見表1。

表1 PAL活性與總黃酮含量間的相關(guān)性分析Table1 Correlation analysis between PAL activity and total flavonoid content

表1顯示了在曬干過程中3 種處理枸杞的PAL活性與總黃酮含量間的相關(guān)性。Pearson相關(guān)系數(shù)均大于0.9，P＜0.01表現(xiàn)為顯著極強(qiáng)正相關(guān)。表明曬干過程中總黃酮含量的變化與PAL活性密切相關(guān)，當(dāng)枸杞遭受失水時，會誘導(dǎo)PAL酶活性的增加，從而增加總黃酮的含量。

2.8 山奈酚、蘆丁和槲皮素含量變化的相關(guān)性分析

表2 3種不同處理方式條件下山奈酚、蘆丁和槲皮素含量相關(guān)性Table2 Correlation analysis among kaempferol, rutin and quercetin contents

表2顯示了3 種處理方式下山奈酚、蘆丁及槲皮素含量間的相關(guān)性。3 種處理方式下山奈酚、蘆丁、槲皮素的含量呈正相關(guān)。在Na2CO3和Na2SO3處理的枸杞中山奈酚、蘆丁和槲皮素含量變化呈極顯著正相關(guān)；在空白對照中槲皮素與山奈酚含量變化呈不顯著正相關(guān)。綜合而言，3 種黃酮類組分變化趨勢相同，在受到外界刺激時，山奈酚、蘆丁與槲皮素含量均呈現(xiàn)相同的變化趨勢。

3 結(jié) 論

曬干工藝會造成枸杞中黃酮類化合物含量的變化。Na2CO3、Na2SO3處理和空白對照的枸杞在曬干過程中PAL活性、總黃酮含量呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，山奈酚、蘆丁和槲皮素含量均呈現(xiàn)先增加后下降趨勢；同一處理下的PAL活性和總黃酮含量變化呈現(xiàn)顯著極強(qiáng)正相關(guān)，山奈酚、蘆丁和槲皮素含量變化呈現(xiàn)正相關(guān)。除蠟劑不會影響曬干過程中黃酮類化合物和PAL活性的變化趨勢，但是影響同一干燥時間下PAL活性、總黃酮、山奈酚、蘆丁和槲皮素含量的大小，并且其達(dá)到最高值的時間也受除蠟劑的影響。

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Variations in Flavonoids and PAL Activity from Lycium barbarum L. during Sun-Drying

LI Peng-liang, LIAO Ruo-yu, WANG Xu, GONG Yuan, LIU Dun-hua*
(School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

In this study, sodium carbonate solution and sodium sulfite solution were used as wax removers to smear the surface of wolfberry (Lycium barbarum L.) fruits and t he fruits without wax removal were used as blank control. The changes in phenylalanine ammonialyase (PAL) activity and total flavonoid content were determined during sun-drying of wolfberries. Variations in kaempferol, rutin and quercetin contents were also analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). Meanwhile, correlation analyses were conducted between the content of total flavonoids and PAL activity, and among the contents of kaempferol, rutin and quercetin. The results showed that continuous accumulations of PAL activity and total flavonoids were determined during sun-drying. The contents of kaempferol, rutin and quercetin increased firstly and then decreased. Using the same wax remover, the content of total flavonoids exhibited a significantly positive correlation with PAL activity. There were also positive correlations among the variations in the contents of kaempferol, rutin and quercetin for the same treatment. Wax removers affected PAL activity and the contents of total flavonoid, kaempferol, rutin and quercetin at the same drying time. The time to reach the highest values of total flavonoids, kaempferol, rutin and quercetin was also influenced by wax removers.

Lycium barbarum L.; flavonoid; phenylalanine ammonialyase; sun-drying; kaempferol; rutin; quercetin

TS255.1

A

1002-6630（2014）23-0079-05

10.7506/spkx1002-6630-201423016

2014-01-14

寧夏回族自治區(qū)科技惠民計劃項目

李朋亮（1987—），男，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：lpl1937@126. com

*通信作者：劉敦華（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：dunhualiu@126.com