丁婧思，聶少平，馮燕玲，王君巧，闕志強(qiáng)

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 3300 47）

茶葉酸性多糖的分離、純化及其理化性質(zhì)研究

丁婧思，聶少平*，馮燕玲，王君巧，闕志強(qiáng)

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 3300 47）

采用水提醇沉法從采自江西婺源的粗老綠茶中提取茶葉多糖，通過(guò)Sevag法脫蛋白得到精制茶葉多糖，應(yīng)用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）分析茶葉多糖純度并測(cè)定其分子質(zhì)量，進(jìn)一步測(cè)定茶葉多糖的糖含量、蛋白質(zhì)含量、單糖組成、糖醛酸組成等理化指標(biāo)，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行紫外和紅外光譜掃描，考察其光譜 性質(zhì)。結(jié)果表明：該茶葉多糖組分為均一性高的酸性多糖組分，分子質(zhì)量 約為289 734 D，糖含量為55.1%，蛋白質(zhì)含量為1.8%。該茶葉多糖酸性組分主要由鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其物質(zhì)的量比為1.26∶3.18∶4.08∶1.00∶1.52∶3.92，該茶葉多糖酸性組分中含有大量半乳糖醛酸，含量為33.5%。

茶葉；酸性多糖；理化性質(zhì)；單糖組成；分子質(zhì)量

茶葉（Camellia sinensis （L.） O. Kuntze）為山茶科山茶屬植物茶的芽葉[1]，作為茶葉的故鄉(xiāng)，中國(guó)是世界產(chǎn)茶大國(guó)。茶葉是世界三大植物性飲料之一[2]，廣受人們的關(guān)注和青睞。茶最初作藥用，后來(lái)發(fā)展為飲料。長(zhǎng)期研究表明，茶葉含有多種活性化學(xué)成分，具有抗氧化、降血脂、降血壓、降血糖、抗腫瘤等藥理作用[3-7]。

茶多糖是從茶葉中提取出的茶葉多糖復(fù)合物的簡(jiǎn)稱(chēng)，其化學(xué)本質(zhì)是一類(lèi)與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的多糖或糖蛋白。茶多糖具有多種生物活性，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其突出功效是降血糖[8-10]，并且在增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗氧化、防血凝及防血栓等方面也有明顯功效[5,11-15]。本實(shí)驗(yàn)以江西婺源粗老綠茶為原料，利用水提醇沉法提取茶葉粗多糖，并通過(guò)Sevag法脫蛋白以純化多糖，應(yīng)用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）分析茶葉多糖純度并測(cè)定其分子質(zhì)量，進(jìn)一步測(cè)定茶葉多糖的糖含量、蛋白質(zhì)含量、單糖組成、糖醛酸組成等理化指標(biāo)，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行紫外和紅外光譜掃描考察其光譜性質(zhì)，為茶多糖的結(jié)構(gòu)及活性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗老綠茶，購(gòu)自江西婺源。

透析袋（8 000～14 000 D）、考馬斯亮藍(lán)G-250（進(jìn)口分裝） 美國(guó)Sigma公司；Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、藍(lán)色葡聚糖 美國(guó)Lazard Freres公司；D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸 上海國(guó)藥試劑公司；牛血清白蛋白 美國(guó)Amersco公司；無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚、咔唑、磷酸、吡啶、三氟乙酸、鹽酸羥胺、醋酸酐、溴化鉀 中國(guó)西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；EYELAN-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 廈門(mén)精藝興業(yè)科技有限公司；SHZ-IIIB循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化有限公司；TGL-5-A離心沉淀機(jī) 上海飛鴿系列離心機(jī)廠；ALPHA1-2冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Martin Christ公司；Millio-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司；MD-200氮?dú)獯祾邇x 杭州奧盛儀器有限公司；TU-1900雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Agilent6890氣相色譜儀、Agilent 1260 高效液相色譜儀美國(guó)Agilent Technologies公司；Nicolet FT-IR 5700傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉多糖的提取及純化

稱(chēng)取100 g干燥的茶葉粉碎，用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液浸泡24 h，去除小分子雜質(zhì)和脂溶性物質(zhì)。用雙層濾布過(guò)濾，濾渣置于通風(fēng)櫥中揮干乙醇后，按料水比1∶10在95 ℃熱水中浸提4 h，間歇攪拌，雙層濾布過(guò)濾，濾渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空濃縮（55 ℃、50 r/min、真空度－0.01 MPa），使?jié)饪s液約為原體積的1/8，向濃縮液中加入無(wú)水乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，于4 ℃冰箱中醇沉24 h，離心分離（4 800 r/min、15 min），棄去上清液，將所得沉淀依次用丙酮、無(wú)水乙醚各洗滌兩次，將沉淀冷凍干燥得茶葉粗多糖。

將干燥的粗多糖按料水比1∶10用蒸餾水溶解，采用Sevag法脫蛋白[16-17]，加入約為樣液體積1/3量的氯仿-正丁醇混合液（4∶1，V/V）劇烈振搖10 min，離心分離（4 800 r/min、15 min），棄去水層與有機(jī)溶液交界處的蛋白質(zhì)層。對(duì)上清液反復(fù)脫蛋白3 次，然后將所得溶液依次用自來(lái)水透析48 h，蒸餾水透析24 h，透析完成后，將透析袋內(nèi)溶液進(jìn)行真空濃縮（55 ℃、50 r/min、真空度－0.01 MPa），冷凍干燥得精制茶葉多糖。

1.3.2 茶葉多糖純度及分子質(zhì)量測(cè)定

分別配制質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的葡萄糖、Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、藍(lán)色葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各2 mL，并過(guò)0.22 μm濾膜制得一系列標(biāo)準(zhǔn)品。稱(chēng)取一定量的茶葉多糖配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，過(guò)0.22 μm濾膜后同上述標(biāo)準(zhǔn)品一起按如下色譜條件過(guò)柱。

色譜條件：色譜柱：UltrahydrogelTMLinear Column（7.8 mm×300 mm，10 μm）；流動(dòng)相：0.02% NaN3溶液；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

以分配系數(shù)（Kav）為縱坐標(biāo)，以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值（lgMw）為縱坐標(biāo)建立回歸方程，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Kav=1.647 2－0.292 6 lgMw，R2=0.993。

1.3.3 糖及蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[18]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定糖含量；采用考馬斯亮藍(lán)法[19]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 單糖組成分析

[20-21]的方法，首先將制得的茶葉多糖經(jīng)過(guò)2 mol/L三氟乙酸（trif uoroacetic acid，TFA）進(jìn)行水解，然后將水解得到的單糖混合物衍生為糖腈乙酸酯，用氣相色譜（gas chromatography，GC）測(cè)定單糖組成。在相同的條件下，分別稱(chēng)取8 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-巖藻糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖、L-鼠李糖）各2 mg，配制成糖腈乙酸酯衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.5 糖醛酸組成分析

按參考文獻(xiàn)[22]中的方法，稱(chēng)取5 mg樣品，用2 mol/L硫酸對(duì)其進(jìn)行水解，將制備好的水解樣品進(jìn)行離子色譜儀分析，同時(shí)分別配制1、2、4、6、8 μg/mL的糖醛酸混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行離子色譜儀分析。

離子色譜條件：色譜柱：CarboPac PA 20（3 mm× 150 mm，6.5 μm）分析柱和CarboPac PA 20（3 mm× 30 mm，6.5 μm）保護(hù)柱；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)器：金電極；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器溫度：35 ℃；淋洗液梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 離子色譜淋洗條件Table1 Ion chromatography elution parameters

1.3.6 紫外光譜掃描分析

將茶葉多糖配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL左右的溶液，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描分析。

1.3.7 紅外光譜掃描分析

取干燥的茶葉多糖1 mg，與KBr研磨后制成透明壓片，采用Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm－1區(qū)內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描分析[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取純化得率

經(jīng)計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)精制茶葉多糖的得率為1.52%。

2.2 茶葉多糖純度及分子質(zhì)量

圖1 茶葉多糖示差檢測(cè)高效凝膠色譜Fig.1 HPGPC of TP S with a RI detector

圖2 茶葉多糖紫外檢測(cè)高效凝膠色譜Fig.2 HPGPC of TPS with a UV detector

由圖1、2可知，茶葉多糖示差檢測(cè)和紫外檢測(cè)色譜峰均為均勻?qū)ΨQ(chēng)單一峰，即該茶 葉多糖為均一糖蛋白。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到茶葉多糖的分子質(zhì)量約為289 734 D，與Guo Li等[24]研究報(bào)道的2.287×105～2.762×105D接近，但與Nie Shaoping等[20]研究報(bào)道的126 513 D有一定差別，結(jié)果的差異可能是茶葉的品種、產(chǎn)地、多糖純化方式不同等原因所致。

2.3 糖及蛋白質(zhì)含量

測(cè)得茶葉多糖的糖含量為55.1%，蛋白質(zhì)含量為1.8%。樣品的糖含量不高，可能是由于樣品中還含有部分糖醛酸。

2.4 單糖組成分析

圖3 標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酸酯衍生物的GGCC圖Fig.3 GC chromatogram of monosaccharide standards

圖4 茶葉多糖水解后單糖糖腈乙酸酯衍生物的GGCC圖Fig.4 GC chromatogram of TPS

由圖3可知，8種單糖標(biāo)品衍生物得到了較好的分離。由圖4可知，茶葉多糖主要由鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6 種單糖組成，其物質(zhì)的量比為1.26∶3.18∶4.08∶1.00∶1.52∶3.92。阿拉伯糖是主要單糖，其次是半乳糖和核糖。其單糖的種類(lèi)和數(shù)目與文獻(xiàn)[25-27]報(bào)道的有一定差異，這可能是由于茶葉的種類(lèi)和分析方法不同所致。

2.5 糖醛酸組成分析

圖5 糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖Fig.5 Ion chromatogram of uronic acid standards

由圖5可知，按照出峰時(shí)間從前往后對(duì)應(yīng)的糖醛酸依次為半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖醛酸（GlcA）。根據(jù)保留時(shí)間可知茶葉多糖中主要含有GalA（圖6），跟據(jù)峰面積計(jì)算可知樣品中半乳糖醛酸含量為33.5%。依據(jù)2.3節(jié)糖、蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果，樣品中糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)三者相加含量超過(guò)90%，表明所制得精制茶葉多糖純度高，雜質(zhì)少。

圖6 茶葉多糖水解后離子色譜圖Fig.6 Ion chromatogram of TPS

2.6 紫外光譜分析結(jié)果

圖7 茶葉多糖溶液的紫外掃描圖譜Fig.7 UV scanning spectrum of TPS

由圖7可知，茶葉多糖在260～280 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有一定吸收，推測(cè)樣品中仍含有部分蛋白質(zhì)。

2.7 紅外光譜分析結(jié)果

圖8 茶葉多糖的紅外光譜Fig.8 IR spectrum of TPS

紅外光譜是一種有效研究分子官能團(tuán)特征的手段，該方法所需樣品數(shù)量少，操作簡(jiǎn)便。從圖8可以得出茶葉多糖的以下結(jié)構(gòu)特征：在3 600～3 300 cm－1之間出現(xiàn)的寬而強(qiáng)的吸收峰應(yīng)該是糖類(lèi)的O—H伸縮振動(dòng)，在3 000～2 800 cm－1之間出現(xiàn)的吸收峰應(yīng)該是甲基或亞甲基C—H的伸縮振動(dòng)，在1 400～1 200 cm－1之間的一組峰應(yīng)該是糖類(lèi)的C—H變角振動(dòng)，由以上3 點(diǎn)可以初步判定該組分為糖類(lèi)物質(zhì)。1 744.8 cm－1處的吸收峰表明茶葉多糖中含有—COO基團(tuán)，1 638.6 cm－1處應(yīng)該是酰胺羧基 的特征吸收峰，1 421.7 cm－1處應(yīng)該是N—H的變角振動(dòng)，962.8 cm－1處應(yīng)該是脫氧糖的次甲基的搖擺振動(dòng)，882.6 cm－1處應(yīng)該是吡喃型半乳糖 或甘露糖的特征吸收峰。

上述分析表明所制備茶葉多糖是一種酸性多糖，與蛋 白質(zhì)綴合，含有吡喃環(huán)。

3 結(jié) 論

本研究采用水提醇沉法從茶葉中提取粗多糖，通過(guò)Sevag法對(duì)粗 多糖脫蛋白得到精制多糖，得率為1.52%。通過(guò)HPGPC的分析，表明所制備茶葉多糖為均一多糖。測(cè)得組分中糖含量為55.1%，蛋白質(zhì)含量為1.8%。以已知分子質(zhì)量的Dextran T-10、DextranT-40、Dextran T-70、Dextra n T-500、藍(lán)色葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得茶葉多糖的分子質(zhì)量約為289 734 D。GC分析確定茶葉多糖主要由鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其物質(zhì)的 量比為1.26∶3.18∶4.08∶1.00∶1.52∶3.92。離子色譜分析得出茶葉多糖中含 有半乳糖醛酸，含量為33.5%。

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Isolation, Purification and Physico-chemical Properties of Acidic Polysaccharides from Green Tea

DING Jing-si, NIE Shao-ping*, FENG Yan-ling, WANG Jun-qiao, QUE Zhi-qiang
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Tea polysaccharides (TPS) were extracted and purified from green tea from Wuyuan of Jiangxi province. The purity and molecular weight (Mw) were determined by high performance gel permeation chromatography (HPGPC). The contents of sugar and protein, monosaccharide compositions, and uronic acid composition were determined as well. UV and IR spectroscopy were used for determining their spectroscopic properties. The results showed that the composition was highly homogeneous acidic polysaccharides. The Mwwas 289 734 D, the content of polysaccharide was 55.1%, and the content of protein was 1.8%. This polysaccharide was mainly composed of rhamnose, ribose, arabinose, mannose, glucose and galactose with a molar ratio of 1.26:3.18:4.08:1.00:1.52:3.92. The major uronic acid was galacturonic acid with a relative content of 33.5%.

tea; acidic polysaccharide; physico-chemical properties; monosaccharide composition; molecular weight

O652.4

A

1002-6630（2014）23-0057-04

10.7506/spkx1002-6630-201423012

2014-06-27

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD33B06）；國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（31130041）；食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目（SKLF-ZZA-201301）

丁婧思（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與分析。E-mail：ding.22@163.com

*通信作者：聶少平（1978—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：spnie@ncu.edu.cn