丁婧思，聶少平，馮燕玲，王君巧，闕志強

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 3300 47）

茶葉酸性多糖的分離、純化及其理化性質(zhì)研究

丁婧思，聶少平*，馮燕玲，王君巧，闕志強

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 3300 47）

采用水提醇沉法從采自江西婺源的粗老綠茶中提取茶葉多糖，通過Sevag法脫蛋白得到精制茶葉多糖，應(yīng)用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）分析茶葉多糖純度并測定其分子質(zhì)量，進一步測定茶葉多糖的糖含量、蛋白質(zhì)含量、單糖組成、糖醛酸組成等理化指標，同時對其進行紫外和紅外光譜掃描，考察其光譜 性質(zhì)。結(jié)果表明：該茶葉多糖組分為均一性高的酸性多糖組分，分子質(zhì)量 約為289 734 D，糖含量為55.1%，蛋白質(zhì)含量為1.8%。該茶葉多糖酸性組分主要由鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其物質(zhì)的量比為1.26∶3.18∶4.08∶1.00∶1.52∶3.92，該茶葉多糖酸性組分中含有大量半乳糖醛酸，含量為33.5%。

茶葉；酸性多糖；理化性質(zhì)；單糖組成；分子質(zhì)量

茶葉（Camellia sinensis （L.） O. Kuntze）為山茶科山茶屬植物茶的芽葉[1]，作為茶葉的故鄉(xiāng)，中國是世界產(chǎn)茶大國。茶葉是世界三大植物性飲料之一[2]，廣受人們的關(guān)注和青睞。茶最初作藥用，后來發(fā)展為飲料。長期研究表明，茶葉含有多種活性化學(xué)成分，具有抗氧化、降血脂、降血壓、降血糖、抗腫瘤等藥理作用[3-7]。

茶多糖是從茶葉中提取出的茶葉多糖復(fù)合物的簡稱，其化學(xué)本質(zhì)是一類與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的多糖或糖蛋白。茶多糖具有多種生物活性，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其突出功效是降血糖[8-10]，并且在增強機體免疫功能、抗氧化、防血凝及防血栓等方面也有明顯功效[5,11-15]。本實驗以江西婺源粗老綠茶為原料，利用水提醇沉法提取茶葉粗多糖，并通過Sevag法脫蛋白以純化多糖，應(yīng)用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）分析茶葉多糖純度并測定其分子質(zhì)量，進一步測定茶葉多糖的糖含量、蛋白質(zhì)含量、單糖組成、糖醛酸組成等理化指標，同時對其進行紫外和紅外光譜掃描考察其光譜性質(zhì)，為茶多糖的結(jié)構(gòu)及活性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗老綠茶，購自江西婺源。

透析袋（8 000～14 000 D）、考馬斯亮藍G-250（進口分裝） 美國Sigma公司；Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、藍色葡聚糖 美國Lazard Freres公司；D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸 上海國藥試劑公司；牛血清白蛋白 美國Amersco公司；無水乙醇、濃硫酸、苯酚、咔唑、磷酸、吡啶、三氟乙酸、鹽酸羥胺、醋酸酐、溴化鉀 中國西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；EYELAN-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 廈門精藝興業(yè)科技有限公司；SHZ-IIIB循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化有限公司；TGL-5-A離心沉淀機 上海飛鴿系列離心機廠；ALPHA1-2冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；Millio-Q超純水儀 美國Millipore公司；MD-200氮氣吹掃儀 杭州奧盛儀器有限公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Agilent6890氣相色譜儀、Agilent 1260 高效液相色譜儀美國Agilent Technologies公司；Nicolet FT-IR 5700傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉多糖的提取及純化

稱取100 g干燥的茶葉粉碎，用體積分數(shù)80%的乙醇溶液浸泡24 h，去除小分子雜質(zhì)和脂溶性物質(zhì)。用雙層濾布過濾，濾渣置于通風櫥中揮干乙醇后，按料水比1∶10在95 ℃熱水中浸提4 h，間歇攪拌，雙層濾布過濾，濾渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空濃縮（55 ℃、50 r/min、真空度－0.01 MPa），使?jié)饪s液約為原體積的1/8，向濃縮液中加入無水乙醇使乙醇體積分數(shù)達到80%，于4 ℃冰箱中醇沉24 h，離心分離（4 800 r/min、15 min），棄去上清液，將所得沉淀依次用丙酮、無水乙醚各洗滌兩次，將沉淀冷凍干燥得茶葉粗多糖。

將干燥的粗多糖按料水比1∶10用蒸餾水溶解，采用Sevag法脫蛋白[16-17]，加入約為樣液體積1/3量的氯仿-正丁醇混合液（4∶1，V/V）劇烈振搖10 min，離心分離（4 800 r/min、15 min），棄去水層與有機溶液交界處的蛋白質(zhì)層。對上清液反復(fù)脫蛋白3 次，然后將所得溶液依次用自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h，透析完成后，將透析袋內(nèi)溶液進行真空濃縮（55 ℃、50 r/min、真空度－0.01 MPa），冷凍干燥得精制茶葉多糖。

1.3.2 茶葉多糖純度及分子質(zhì)量測定

分別配制質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的葡萄糖、Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、藍色葡聚糖標準溶液各2 mL，并過0.22 μm濾膜制得一系列標準品。稱取一定量的茶葉多糖配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，過0.22 μm濾膜后同上述標準品一起按如下色譜條件過柱。

色譜條件：色譜柱：UltrahydrogelTMLinear Column（7.8 mm×300 mm，10 μm）；流動相：0.02% NaN3溶液；流速：0.6 mL/min；檢測器：示差檢測器和紫外檢測器；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

以分配系數(shù)（Kav）為縱坐標，以葡聚糖標準品分子質(zhì)量對數(shù)值（lgMw）為縱坐標建立回歸方程，得到標準曲線方程為：Kav=1.647 2－0.292 6 lgMw，R2=0.993。

1.3.3 糖及蛋白質(zhì)含量測定

采用苯酚-硫酸法[18]，以葡萄糖為標準，在490 nm波長處測定糖含量；采用考馬斯亮藍法[19]，以牛血清白蛋白為標準，在595 nm波長處測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 單糖組成分析

[20-21]的方法，首先將制得的茶葉多糖經(jīng)過2 mol/L三氟乙酸（trif uoroacetic acid，TFA）進行水解，然后將水解得到的單糖混合物衍生為糖腈乙酸酯，用氣相色譜（gas chromatography，GC）測定單糖組成。在相同的條件下，分別稱取8 種單糖標準品（D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-巖藻糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖、L-鼠李糖）各2 mg，配制成糖腈乙酸酯衍生物混合標準品進行氣相色譜分析。

1.3.5 糖醛酸組成分析

按參考文獻[22]中的方法，稱取5 mg樣品，用2 mol/L硫酸對其進行水解，將制備好的水解樣品進行離子色譜儀分析，同時分別配制1、2、4、6、8 μg/mL的糖醛酸混合標準品進行離子色譜儀分析。

離子色譜條件：色譜柱：CarboPac PA 20（3 mm× 150 mm，6.5 μm）分析柱和CarboPac PA 20（3 mm× 30 mm，6.5 μm）保護柱；流速：0.5 mL/min；檢測器：金電極；柱溫：30 ℃；檢測器溫度：35 ℃；淋洗液梯度洗脫條件見表1。

表1 離子色譜淋洗條件Table1 Ion chromatography elution parameters

1.3.6 紫外光譜掃描分析

將茶葉多糖配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL左右的溶液，采用紫外-可見分光光度計在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描分析。

1.3.7 紅外光譜掃描分析

取干燥的茶葉多糖1 mg，與KBr研磨后制成透明壓片，采用Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm－1區(qū)內(nèi)進行紅外光譜掃描分析[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取純化得率

經(jīng)計算，本實驗精制茶葉多糖的得率為1.52%。

2.2 茶葉多糖純度及分子質(zhì)量

圖1 茶葉多糖示差檢測高效凝膠色譜Fig.1 HPGPC of TP S with a RI detector

圖2 茶葉多糖紫外檢測高效凝膠色譜Fig.2 HPGPC of TPS with a UV detector

由圖1、2可知，茶葉多糖示差檢測和紫外檢測色譜峰均為均勻?qū)ΨQ單一峰，即該茶 葉多糖為均一糖蛋白。由標準曲線方程計算得到茶葉多糖的分子質(zhì)量約為289 734 D，與Guo Li等[24]研究報道的2.287×105～2.762×105D接近，但與Nie Shaoping等[20]研究報道的126 513 D有一定差別，結(jié)果的差異可能是茶葉的品種、產(chǎn)地、多糖純化方式不同等原因所致。

2.3 糖及蛋白質(zhì)含量

測得茶葉多糖的糖含量為55.1%，蛋白質(zhì)含量為1.8%。樣品的糖含量不高，可能是由于樣品中還含有部分糖醛酸。

2.4 單糖組成分析

圖3 標準單糖糖腈乙酸酯衍生物的GGCC圖Fig.3 GC chromatogram of monosaccharide standards

圖4 茶葉多糖水解后單糖糖腈乙酸酯衍生物的GGCC圖Fig.4 GC chromatogram of TPS

由圖3可知，8種單糖標品衍生物得到了較好的分離。由圖4可知，茶葉多糖主要由鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6 種單糖組成，其物質(zhì)的量比為1.26∶3.18∶4.08∶1.00∶1.52∶3.92。阿拉伯糖是主要單糖，其次是半乳糖和核糖。其單糖的種類和數(shù)目與文獻[25-27]報道的有一定差異，這可能是由于茶葉的種類和分析方法不同所致。

2.5 糖醛酸組成分析

圖5 糖醛酸標準品離子色譜圖Fig.5 Ion chromatogram of uronic acid standards

由圖5可知，按照出峰時間從前往后對應(yīng)的糖醛酸依次為半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖醛酸（GlcA）。根據(jù)保留時間可知茶葉多糖中主要含有GalA（圖6），跟據(jù)峰面積計算可知樣品中半乳糖醛酸含量為33.5%。依據(jù)2.3節(jié)糖、蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果，樣品中糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)三者相加含量超過90%，表明所制得精制茶葉多糖純度高，雜質(zhì)少。

圖6 茶葉多糖水解后離子色譜圖Fig.6 Ion chromatogram of TPS

2.6 紫外光譜分析結(jié)果

圖7 茶葉多糖溶液的紫外掃描圖譜Fig.7 UV scanning spectrum of TPS

由圖7可知，茶葉多糖在260～280 nm波長范圍內(nèi)有一定吸收，推測樣品中仍含有部分蛋白質(zhì)。

2.7 紅外光譜分析結(jié)果

圖8 茶葉多糖的紅外光譜Fig.8 IR spectrum of TPS

紅外光譜是一種有效研究分子官能團特征的手段，該方法所需樣品數(shù)量少，操作簡便。從圖8可以得出茶葉多糖的以下結(jié)構(gòu)特征：在3 600～3 300 cm－1之間出現(xiàn)的寬而強的吸收峰應(yīng)該是糖類的O—H伸縮振動，在3 000～2 800 cm－1之間出現(xiàn)的吸收峰應(yīng)該是甲基或亞甲基C—H的伸縮振動，在1 400～1 200 cm－1之間的一組峰應(yīng)該是糖類的C—H變角振動，由以上3 點可以初步判定該組分為糖類物質(zhì)。1 744.8 cm－1處的吸收峰表明茶葉多糖中含有—COO基團，1 638.6 cm－1處應(yīng)該是酰胺羧基 的特征吸收峰，1 421.7 cm－1處應(yīng)該是N—H的變角振動，962.8 cm－1處應(yīng)該是脫氧糖的次甲基的搖擺振動，882.6 cm－1處應(yīng)該是吡喃型半乳糖 或甘露糖的特征吸收峰。

上述分析表明所制備茶葉多糖是一種酸性多糖，與蛋 白質(zhì)綴合，含有吡喃環(huán)。

3 結(jié) 論

本研究采用水提醇沉法從茶葉中提取粗多糖，通過Sevag法對粗 多糖脫蛋白得到精制多糖，得率為1.52%。通過HPGPC的分析，表明所制備茶葉多糖為均一多糖。測得組分中糖含量為55.1%，蛋白質(zhì)含量為1.8%。以已知分子質(zhì)量的Dextran T-10、DextranT-40、Dextran T-70、Dextra n T-500、藍色葡聚糖為標準品作標準曲線，測得茶葉多糖的分子質(zhì)量約為289 734 D。GC分析確定茶葉多糖主要由鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其物質(zhì)的 量比為1.26∶3.18∶4.08∶1.00∶1.52∶3.92。離子色譜分析得出茶葉多糖中含 有半乳糖醛酸，含量為33.5%。

參考文獻：

[1] 李敏. 茶葉的化學(xué)成分研究[D]. 沈陽: 沈陽藥科大學(xué), 2008: 4.

[2] 申明月, 聶少平, 謝明勇. 茶葉多糖的純化及其光譜特性研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(11): 39-43.

[3] 林智. 茶葉的保健作用及其機理[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2003(4): 49-52.

[4] 姜玉芳, 吳遠雙, 宋玉竹, 等. 茶葉減肥降脂機制研究進展[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(14): 353-357.

[5] 劉軍海, 李志洲. 茶葉中有效成分應(yīng)用及其提取工藝研究進展[J].食品研究與開發(fā), 2007, 28(3): 173-177.

[6] SHARMA V, RAO L J M. A thought on the biological activities of black tea[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2009, 49(5): 379-404.

[7] 張建海, 馮彬彬. 茶葉主要藥效成分的藥理作用及應(yīng)用[J]. 寧夏農(nóng)林科技, 2012, 53(1): 84-85.

[8] 謝明勇, 聶少平. 茶葉多糖的研究進展[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2006, 25(2): 108-114.

[9] 崔宏春, 余繼忠, 黃海濤, 等. 茶多糖的提取及分離純化研 究進展[J].茶葉, 2011, 37(2): 67-71.

[10] 鄧澤元, 褚芳. 茶葉對老齡大鼠血糖、血脂及抗氧化功能的影響[J].茶葉科學(xué), 1998, 18(1): 74-77.

[11] WANG Yuanfeng, WEI Xinlin, JIN Zhengyu. Structure analysis of a neutral polysaccharide isolated from green tea[J]. Food Research International, 20 09, 42(5): 739-745.

[12] NIE Shaoping, X IE Mingyong. A review on the isolation and structure of tea polysaccharides and their bioactivities[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(2): 144-149.

[13] CHEN Haixia, ZHANG Min, XIE Bijun. Components and antioxidant activity of polysaccharide conjugate f rom green tea[J]. Food Chemistry, 2005, 90(1): 1 7-21.

[14] CAI Weirong, XIE Liangliang, CHEN Yong, et al. Purification, characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 92(2): 1086-1090.

[15] YANG Liqun, ZHANG Liming. Chemical structural and chain conformational characterization of some bioactive polysaccharides isolated from natural sources[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 76(3): 349-361.

[16] 周鵬, 謝明勇, 傅博強, 等. 茶葉粗多糖的提取及純化研究[J]. 食品科學(xué), 2001, 22(11): 46-47.

[17] 朱玉強. 茶多糖提純、精制及其生理活性研究進展[J]. 福建茶葉, 2006(3): 12-14.

[ 18] 吳曉鵬, 王一飛, 劉秋英, 等. 苦丁茶多糖的提取分離純化及部分理化性質(zhì)研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2007, 33(6): 141-144.

[19] 陳小強, 成浩, 葉陽, 等. 茶多糖純化組分的理化分析[J]. 中草藥, 2009, 39(6): 828-830.

[20] NIE Shaoping, XIE Mingyong, FU Zhihong, et al. Study on the purification and chemical compositions of tea glycoprotein[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 71(4): 626-633.

[21] LV You, YANG Xingbing, ZHAO Yan, et al. Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum by HPLC with indirect UV detection[J]. Food Chemistry, 2009, 112(3): 742-746.

[22] 霍江雷. 茶葉多糖的分離純化工藝及結(jié)構(gòu)研究[D]. 上海: 上海師范大學(xué), 2012: 24.

[23] 林華娟, 田曉春, 秦小明, 等. 金花茶多糖單一成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征解析[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(3): 141-146.

[24] GUO Li, DU Xiangfeng, LAN Jing, et al. Study on molecular structural characteristics of tea polysaccharide[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2010, 4 7(2): 244-249.

[25] GUO Wei, ZHOU Binxing, LUO Ling, et al. Analysis of monosaccharide composition of Pu-erh tea polysaccaride by precolumn derivatization HPL C[J]. Agricultural Science & Technology, 2013, 14(4): 556-558.

[26] 江和源, 陳小強, 寇小紅, 等. 茶多糖的分級純化及組成分析[J]. 茶葉科學(xué), 2007, 27(3): 248-252.

[27] 楊江帆, 鄭德勇, 葉乃興, 等. 烏龍茶多糖的單糖組成及結(jié)構(gòu)的研究[J].茶葉科學(xué)技術(shù), 2007(4): 1-3.

Isolation, Purification and Physico-chemical Properties of Acidic Polysaccharides from Green Tea

DING Jing-si, NIE Shao-ping*, FENG Yan-ling, WANG Jun-qiao, QUE Zhi-qiang
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Tea polysaccharides (TPS) were extracted and purified from green tea from Wuyuan of Jiangxi province. The purity and molecular weight (Mw) were determined by high performance gel permeation chromatography (HPGPC). The contents of sugar and protein, monosaccharide compositions, and uronic acid composition were determined as well. UV and IR spectroscopy were used for determining their spectroscopic properties. The results showed that the composition was highly homogeneous acidic polysaccharides. The Mwwas 289 734 D, the content of polysaccharide was 55.1%, and the content of protein was 1.8%. This polysaccharide was mainly composed of rhamnose, ribose, arabinose, mannose, glucose and galactose with a molar ratio of 1.26:3.18:4.08:1.00:1.52:3.92. The major uronic acid was galacturonic acid with a relative content of 33.5%.

tea; acidic polysaccharide; physico-chemical properties; monosaccharide composition; molecular weight

O652.4

A

1002-6630（2014）23-0057-04

10.7506/spkx1002-6630-201423012

2014-06-27

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B06）；國家自然科學(xué)基金重點項目（31130041）；食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室目標導(dǎo)向項目（SKLF-ZZA-201301）

丁婧思（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)與分析。E-mail：ding.22@163.com

*通信作者：聶少平（1978—），男，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)、食品營養(yǎng)與安全。E-mail：spnie@ncu.edu.cn