劉 超，徐 立，劉 靜，鄭 曼

（西南大學生物技術學院，重慶 400715）

桑枝提取物中1-脫氧野尻霉素的穩(wěn)定性研究

劉 超，徐 立*，劉 靜，鄭 曼

（西南大學生物技術學院，重慶 400715）

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是桑樹中的一種含氮糖類化合物，具有高效的降血糖活性、巨大的保健和藥用潛力，其穩(wěn)定性研究非常必要。本實驗借助高效液相色譜儀測定DNJ含量的變化，分別研究微波、超聲波、酸堿、加熱、紫外光和自然光6 個因素對桑枝提取物中DNJ穩(wěn)定性的影響。結果表明微波可以明顯破壞DNJ，800 W功率處理1 h可使DNJ的損耗率達65%，而超聲波對DNJ穩(wěn)定性的影響不大，且在不同功率的一定時間點還可以增加提取物中DNJ的含量；加熱對DNJ的穩(wěn)定性有一定程度的影響；pH值與光照對DNJ的穩(wěn)定性影響較微弱。這些結果可為天然DNJ的生產和儲存工藝的研究以及桑枝的開發(fā)利用提供有效參考。

1-脫氧野尻霉素；桑枝提取物；穩(wěn)定性；高效液相色譜

桑枝是一種中國傳統(tǒng)草藥，其藥用與保健功效在歷代藥典中多有記載?，F(xiàn)代植物化學研究表明，桑樹中富含的結構與α-1,4-葡萄糖類似的天然活性物質1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）具備明顯的降血糖[1-6]、抗腫瘤[7]和抗病毒[8-9]活性，有治療病毒感染、肥胖癥、糖尿病等多種疾病的潛能[10]，已經成為多種功能性食品的主要活性成分[11]，是目前天然活性物質研究中的熱點之一。因此，天然DNJ的提取、分離純化與基團改造等研究及生產過程中的穩(wěn)定性研究是非常必要的，目前除了Kazuhisa等[12]對蠶粉中DNJ在121 ℃的穩(wěn)定性進行過描述外，卻鮮見其他穩(wěn)定性方面的研究和探索。

影響天然活性物質穩(wěn)定性的因素主要包括溫度、酸堿度及光照。此外，作為在傳統(tǒng)有機溶劑萃取基礎上發(fā)展起的新型萃取技術，微波和超聲波輔助萃取因具有方便快速、節(jié)能環(huán)保、回收率高等優(yōu)點[13-16]，已被廣泛應用于食品化學和中藥提取方面，且在DNJ的研究中也有利用[17-19]。本實驗基于此研究了微波、超聲波、溫度、酸堿度及光照對DNJ穩(wěn)定性的影響，以期為DNJ的提取、分離和貯藏等研究和生產過程以及桑枝的開發(fā)利用提供數(shù)據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆藥桑枝條由新疆維吾爾自治區(qū)和田蠶?？茖W研究所提供。

DNJ標準品、9-芴甲氧羰酰氯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)moc-Cl）、乙腈（色譜級） 美國Sigma公司；甘氨酸 大川精細化工有限公司；氯化鉀、硼酸 成都科龍化工試劑廠；乙酸（分析級）、乙醇（工業(yè)級） 重慶川東化工有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；微波爐（頻率2 450 MHz，最大輸出功率800 W） 格蘭仕微波爐電器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（頻率40 kHz，最大輸出功率700 W）昆山市超聲儀器有限公司；純水儀 法國Millipore公司；旋轉蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責任公司；超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；電子計價秤 大陽衡器有限公司；渦旋儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

4.5 kg桑枝粉碎后，用75%的乙醇以液料比10∶1（V/m）提取4 次，每次24 h。提取液用砂芯漏斗過濾并減壓濃縮至無醇味，正丁醇萃取。所得正丁醇部分減壓濃縮至浸膏，用1 500 mL蒸餾水溶解，保存于棕色瓶中待用。

1.3.2 微波和超聲波對提取物的處理

每個6 mL的玻璃收集瓶中加入1 mL樣品，分別在320、480、640、800 W微波功率下處理0、5、10、20、30、40、50、60 min。各瓶樣品用蒸餾水定容至2 mL，并取10 μL衍生化，放在4 ℃冰箱中待測。每個處理3 個重復。

每個4 mL的離心管中加入2 mL樣品，分別在280、420、560、700 W超聲波功率下處理0、10、20、40、60、80、100、120 min。各管樣品取10 μL衍生化，放在4 ℃冰箱中待測。每個處理3 個重復。

1.3.3 酸堿和加熱對提取物的處理

用1 mol/L鹽酸和氫氧化鈉溶液調樣品的pH值至2.0、4.5、7.0、9.5、12.0，分別移取25 mL于25 mL棕色容量瓶中。每8 d取10 μL于0.5 mL離心管中，衍生化，放在4 ℃冰箱中待測，連續(xù)取5 次。每個處理3 個重復。

移取25 mL樣品于25 mL棕色容量瓶中，分別在55、70、85、100 ℃的水浴條件下加熱0、4、8、12、16、20、24、30 h。各溫度處理組每4 h（最后一次間隔6 h）用蒸餾水定容至25 mL后取10 μL，衍生化，放在4 ℃冰箱中待測。每個處理3 個重復。

1.3.4 自然光和紫外光對提取物的處理

25 mL樣品分別定容于25 mL棕色和白色容量瓶中，置于20 W熒光燈下距離20 cm處照射[20]，每2 d取10 μL于0.5 mL離心管中，衍生化，放在4 ℃冰箱中待測，連續(xù)取6 次（最后兩次分別間隔3 d和4 d）。每個處理3 個重復。

25 mL樣品分別定容于25 mL棕色和白色容量瓶中，置于18 W紫外燈下距離20 cm處照射[20]，其他處理同熒光燈處理。

1.3.5 超聲波和100 ℃加熱對DNJ標準品的處理

由于超聲波和100 ℃加熱對提取物的處理結果出現(xiàn)DNJ含量中途增加的趨勢，為一定程度上驗證推測的結果，增加了超聲波和100 ℃加熱對DNJ標準品的處理，方法分別同1.3.2節(jié)中超聲波對提取物的處理和1.3.3節(jié)加熱對提取物的處理。

1.3.6 DNJ含量的HPLC測定

參照Kim[16]、Chen Yajie[21]、魏兆軍[22]等的方法，將30 μL以上各種處理后的處理液或DNJ標準品溶液與30 μL的硼酸鉀緩沖液（0.4 mol/L，pH 8.5）混合于0.5 mL離心管中，加入60 μL 5 mmol/L的Fmoc-Cl，25 ℃條件下水浴20 min，再加入30 μL 1 mol/L的甘氨酸終止反應。用30 μL體積分數(shù)0.1%乙酸溶液穩(wěn)定新生成的DNJ-Fmoc，并以蒸餾水定容至300 μL，0.22 μm尼龍濾膜過濾，置于4 ℃冰箱待測。每步都渦旋振蕩10 s，以使溶液充分混合。

DNJ的HPLC檢測條件：5 μm C18（4.6 mm×150 mm）反相色譜柱，流動相為乙腈-0.1%醋酸（55∶45，V/V）流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 DNJ標準曲線的測定與HPLC分析

圖1 DNJ標準品（a）和桑枝提取物（b）的HPLC圖Fig.1 Chromatogram of DNJ standard (a) and Ramulus mori extract (b)

DNJ標準曲線的線性回歸方程為y = 2 870.6x－1 709，R2=0.999 4，其線性取值范圍是0～240 μg/mL。如圖1所示，DNJ的保留時間約為2.15 min，色譜吸收峰較明顯，說明本實驗的檢測條件可行。

2.2 微波和超聲波對DNJ穩(wěn)定性的影響

圖2 微波對提取物中DNJ穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of microwave on DNJ stability in the extract

由圖2可知，隨著微波處理時間的延長，同一功率組中DNJ的含量逐漸下降，且功率越大，含量下降的速率越快；480、640、800 W處理組的DNJ變化走勢較相似，1 h內損耗率達50%～65%，而320 W較平緩，1 h內損耗率為22.6%。說明微波對DNJ穩(wěn)定性有明顯的影響。在微波熱效應作用下，高頻振蕩可使受熱物質中的極性分子間產生內摩擦而整體致熱，溫度均勻升高。且有報道顯示微波能引起蛋白亞基結構的變化，削弱亞基間的相互作用[23]。所以推斷DNJ在微波熱效應作用下，結構中的基團被破壞或發(fā)生反應，進而致使其含量降低，即穩(wěn)定性下降。也不排除受到了微波的電、磁及化學等非熱效應的綜合影響。此外，實驗發(fā)現(xiàn)，樣品經微波短時間處理就可揮發(fā)掉其中幾乎所有的水分，變?yōu)榻?，因此建議在獲取DNJ浸膏的過程中，可先用旋轉蒸發(fā)儀去掉大部分溶劑，而后在其穩(wěn)定性較好的處理時段內，用微波除去黏稠液中剩余的難揮發(fā)液體，快速得到浸膏。

圖3 超聲波對提取物中DNJ（a）和DNJ標準品（b）穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of ultrasonic on the stability of DNJ in the extracts (a) and DNJ standards (b)

由圖3a可知，不同超聲波功率組中，處理開始的一段時間，隨著時間的延長，DNJ的含量逐漸下降；中間突然出現(xiàn)一增長點后DNJ的含量又隨著時間的延長而逐漸下降，但各功率間變化的幅度和趨勢都相差不大。由圖3b可知，處理2 h后各組的損耗率都在20%之內，說明超聲波對DNJ的穩(wěn)定性有一定的影響。有研究發(fā)現(xiàn)超聲波能破壞淀粉支鏈結構和長鏈，使直鏈淀粉含量增加[24]。故結合圖3a、3b推測700 W處理20 min、560 W處理60 min、 420 W處理80 min和280 W處理100 min后出現(xiàn)的含量突然增加的變化趨勢，可能是由于桑樹中含有的DNJ糖苷，DNJ類似物（如N-甲基-1-脫氧野尻霉素、2-O-α-D-吡喃半乳糖基-l-脫氧野尻霉素、6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-l-脫氧野尻霉素、4-O-D-吡喃葡萄糖基-l-脫氧野尻霉素、6-O-α-D-吡喃半乳糖基-l-脫氧野尻霉素、2-OD-吡喃葡萄糖基-l-脫氧野尻霉素或3-O-α-D-吡喃葡萄糖基-l-脫氧野尻霉素等）[25-28]，或以酰胺、酯等形式存在的DNJ[29]在超聲波機械效應、空化效應及熱效應的作用下，與溶劑分子之間的的摩擦碰撞被加速，產生的高壓環(huán)境導致了鏈的斷裂，即超聲波可能促進某些化學反應的進行[30]，進而導致了類似物結構發(fā)生變化，部分變成了DNJ。但這些桑樹DNJ的類似物中只有N-甲基-1-脫氧野尻霉素在桑枝內被發(fā)現(xiàn)[31]，而N-甲基-1-脫氧野尻霉素不能與Fmoc-Cl發(fā)生衍生反應[16]，在實驗所得的結果圖中無法推測其出峰位置，難于為此推論提供結果依據，但理論上N-甲基-1-脫氧野尻霉素在超聲波催化下變化致DNJ含量增高的可行性很大。然而，由圖3a、3b也可以看出，DNJ標準品單位時間內的損耗率比提取物中DNJ的損耗率要大，可能是由于提取物中各種大小分子物質在波的傳遞過程中，一定程度上損耗了其部分能量，致使在相同功率的處理條件下，作用于提取物中DNJ的能量要低于DNJ標準品的能量。當然，也不排除提取物中一些黏性物質的物理作用或帶有特殊官能團物質的分子間作用對DNJ起到了一定程度上的保護效果。

2.3 酸堿和加熱對DNJ穩(wěn)定性的影響

圖4 pH值對提取物中DNJ穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on DNJ stability in the extract

如圖4所示，同一pH值處理組中，隨著放置時間的延長，DNJ的含量緩慢降低，變化趨勢近似，且40 d損耗率在10%之內；不同處理組間，DNJ的損耗率具有一定的差異性，但總體相差不大，說明pH值對DNJ的穩(wěn)定性影響不大。從圖中可以看出在酸性環(huán)境比堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性稍好，這可能由于DNJ屬于一種生物堿，本身略帶正電荷，顯堿性，在酸性條件下成鹽，增加了其穩(wěn)定性；而堿性條件一定程度上可促使胺鍵開環(huán)[32]，破壞了DNJ的結構，進而降低了其穩(wěn)定性。

圖5 溫度對提取物中DNJ（a）和100 ℃對DNJ 標準品（b）穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on DNJ stability in the extract (a) and effect of treatment at 100 ℃ on the stability of DNJ standard (b)

如圖5a所示，在55、70和85 ℃處理組中，DNJ的含量隨著時間的延長而減少，溫度越高含量減少的越快，30 h的損耗率在10%～15%之間，且時間越長變化的趨勢越明顯。但100 ℃處理組中，DNJ含量的變化趨勢卻是先降低再增加，然后再降低的過程，結合圖5b推測是由于一定時間的高溫使樣品中N-甲基-1-脫氧野尻霉素等DNJ類似物或DNJ糖苷的結構遭到破壞，從而導致DNJ含量增加。但其趨勢線中的凸起不像超聲波那樣突現(xiàn)，是由于超聲波有一定的穿透性，可使樣品內外短時間內受到同樣的影響，而水浴加熱則需一個傳導過程，故變化趨勢相對平緩。結果總體表明加熱可降低DNJ的穩(wěn)定性，時間越長、溫度越高穩(wěn)定性變化越大。

2.4 紫外光和自然光對DNJ穩(wěn)定性的影響

圖6 光照對提取物中DNJ穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of light on DNJ stability in the extract

如圖6所示，紫外光和自然光處理組，白色瓶和棕色瓶中的DNJ含量變化趨勢都比較接近，說明光照對DNJ的穩(wěn)定性幾乎沒有影響。但對于白色瓶中DNJ的損耗率，紫外光組卻稍微高于自然光組，15 d內其損耗率僅相差0.65%。說明與其他物質相似，紫外光所能引起的光降解反應[33]也可能適用于DNJ，但其作用比較微弱。也不排除樣品中物質種類較多，不乏一些有色物質吸收或阻擋了部分光線，一定程度上減小了光照對DNJ的破壞程度。

3 結 論

環(huán)境因素是影響活性物質穩(wěn)定性的主要因素之一，一般由溫度、酸堿度及光組成。此外，在天然DNJ提取、分離及應用過程中，微波與超聲波以其高效、方便和環(huán)保等方面的先進性正在越來越多的被運用到。由此，本實驗分別研究了微波、超聲波、酸堿、加熱、紫外光和自然光對桑枝粗提物中DNJ穩(wěn)定性的影響。結果表明微波可以明顯破壞DNJ的穩(wěn)定性，而超聲波的破壞作用不強，且在一定功率的一定時間點還可以增加提取物中DNJ的含量；加熱對DNJ的穩(wěn)定性有一定程度的影響；pH值與光照對DNJ的穩(wěn)定性影響較微弱。實驗結果為天然DNJ的生產和貯藏工藝提供了可用的數(shù)據參考。

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Stability Analysis of 1-Deoxynojirimycin in Ramulus mori Extract

LIU Chao, XU Li*, LIU Jing, ZHENG Man
(College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China)

1-Deoxynojirimycin (DNJ) has efficient hypoglycemic activity and huge health and medicinal potential. Therefore, the study of its stability is very meaningful. In this study, the effects of six factors including microwave, ultrasonic, acid and alkali, heat, ultraviolet light and natural light on the stability of DNJ in Ramulus mori extract were explored, and the contents were measured by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that microwave could destabilize DNJ obviously, and DNJ loss rate was 65% when treating it for 1 h with a power of 800 W. Yet ultrasound had little effect on DNJ stability, and the content of DNJ in the extract was increased at a certain time point during the treatment under various powers. Heating had an observable influence on the stability of DNJ, but the effects of pH and light on the stability of DNJ were weak. The results can provide effective references for the production and storage of natural DNJ.

1-deoxynojirimycin (DNJ); Ramulus mori extract; stability; high performance liquid chromatography

TQ464.4

A

1002-6630（2014）23-0052-05

10.7506/spkx1002-6630-201423011

2013-12-31

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目（XDJK2013C053）

劉超（1988—），男，碩士研究生，主要從事植物化學研究。E-mail：liuchao212@foxmail.com

*通信作者：徐立（1976—），男，副教授，博士，主要從事植物化學研究。E-mail：mulberry@swu.edu.cn