肖霞 繆建華 李樹春 吳建中 于韶榮 馮繼鋒

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。幾十年來順鉑作為肺癌化療的基礎(chǔ)藥物，在肺癌治療中占有舉足輕重的地位。盡管如此，仍然有很多初始化療有效的患者經(jīng)過一段時間的治療后出現(xiàn)了對順鉑敏感性降低的現(xiàn)象。而影響患者對順鉑敏感性的因素有很多，包括癌細(xì)胞內(nèi)順鉑的蓄積含量［1-3］、解毒能力［4］以及DNA的修復(fù)功能［5］等，同時，腫瘤微環(huán)境的改變也是其重要的影響因素。

在腫瘤微環(huán)境下細(xì)胞間的作用方式有很多種，目前，一種膜性微囊泡exosomes(即外分泌體)在細(xì)胞信息傳遞中的作用逐漸受到重視［6］。exosomes是直徑為30～100 nm的內(nèi)吞來源的膜性囊泡［7］，由多種細(xì)胞分泌并存在于多種體液中，研究表明exosomes中含有大量的microRNAs，mRNAs和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，并且細(xì)胞可以通過胞吞作用內(nèi)化微環(huán)境中的exosomes，exosomes進(jìn)入受體細(xì)胞后釋放出其所攜帶的包括miRNA、mRNA在內(nèi)的遺傳信息引起受體細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)，因此exosomes被認(rèn)為是一種參與細(xì)胞間信息交流的載體［8］。同時，不同細(xì)胞分泌的exosomes具有不同的特性及生物學(xué)功能，同種細(xì)胞在不同環(huán)境下分泌的exosomes也具有不同的特性及生物學(xué)功能。而exosomes生物學(xué)功能的差異主要取決于其表面攜帶的相關(guān)分子及內(nèi)部裝載的信息。如果攜帶的信息與增殖有關(guān)，那么exosomes可在進(jìn)入受體細(xì)胞后調(diào)節(jié)其下游通路，影響細(xì)胞的增殖［9-10］;如果攜帶的信息與血管生成調(diào)節(jié)有關(guān)，那么exosomes在進(jìn)入受體細(xì)胞后可影響其血管形成［11］;如果攜帶的信息與轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)，那么exosomes在進(jìn)入細(xì)胞后可影響其侵襲性［12-13］。研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞來源的exosomes可能參與前列腺腫瘤細(xì)胞對多西他賽的耐藥形成［14］。

本研究以肺癌A549和H1975細(xì)胞為模型，探討順鉑處理后肺癌細(xì)胞來源的exosomes對同源細(xì)胞的順鉑敏感性的影響，為順鉑敏感性調(diào)節(jié)機(jī)制提供一條新的思路，也為提高肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞株A549和H1975均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，生長于含有10%滅活胎牛血清(Hyclone，美國)的含雙抗的RPMI 1640(凱基生物，南京)培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2、85%濕度的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶(Gibico，美國)消化液消化傳代。所有實(shí)驗(yàn)均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。1.2exosomes的制備、電鏡觀察和蛋白檢測肺腺癌細(xì)胞A549和H1975培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清液用于exosomes的制備。首先，收集的上清液通過一系列離心去除細(xì)胞及碎片:1000 g×10 min、10 000 g×30 min 4℃、100 000 g×2 h 4℃(Beckman 70 Ti rotor，美國)，取濃縮液，然后加入exoquick-TC(System Biosciences，Mountain View，美國)，經(jīng)1500 g×30 min 4℃離心獲取的沉淀即為exosomes。用PBS重懸后置于-80℃保存。

將exosomes稀釋后取20 μl滴加于銅網(wǎng)上，晾干后即在透射電鏡(TEM，JEM-2100，JEOL，日本)下觀察。

取exosomes用裂解液裂解后加入1×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，加樣于上樣孔內(nèi)，濃縮膠80 V，30 min，分離膠100 V，90 min。然后轉(zhuǎn)膜250 mA，60 min，室溫封閉后，一抗采用兔抗鼠CD63(System Biosciences，Mountain View，Calif)，4℃過夜。二抗采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(System Biosciences，Mountain View，美國)，室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒(Peirce)于成像儀(Bio-Rad)中顯色。

1.3 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞胞吞exosomes的過程將提取的exosomes用PBS稀釋后，取DiD染料(Biotium，美國)2 μl，加入1 ml稀釋后的exosome重懸液中室溫孵育0.5 h，再以20，000 g×30 min，4℃離心后取上清，濾器(0.22 μm，millipore，美國)過濾，以每孔取液40 μl，加入60 μl PBS混勻后加入六孔板中，培養(yǎng)3 h后用共聚焦顯微鏡觀察exosomes是否進(jìn)入細(xì)胞中。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于96孔板中(6×103個/孔)，24 h貼壁后加入順鉑(濃度分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/ml)，培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μl CCK-8(Dojindo，Kumamoto，日本)和90 μl不完全培養(yǎng)基的混合液，0.5 h后，用酶標(biāo)儀測450 nm波長下的光密度值。檢測H1975細(xì)胞存活率的方法同上。

同樣，取對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于96孔板中(6×103個/孔)，24 h貼壁后將培養(yǎng)液換成不含exosomes的培養(yǎng)液，NOR EXO組以未經(jīng)順鉑處理的A549細(xì)胞來源的exosomes預(yù)處理細(xì)胞，DDP EXO組以經(jīng)順鉑處理的A549細(xì)胞來源的exosomes預(yù)處理細(xì)胞，而PBS組以等量的PBS預(yù)處理細(xì)胞，3 h后對3組的細(xì)胞以3 μg/ml的順鉑處理，48 h后每孔加入10 μl CCK-8和90 μl不完全培養(yǎng)基的混合液，0.5 h后，用酶標(biāo)儀測450 nm波長下的光密度值。檢測H1975細(xì)胞存活率的方法同上。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以ˉx±s表示，組間的比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 exosomes的形態(tài)學(xué)特征和蛋白表達(dá)通過不同梯度的超速離心和exoquick-TC，從肺癌A549細(xì)胞的上清液中分離出腫瘤來源的exosomes，然后通過透射電鏡對其形態(tài)進(jìn)行了觀察。如圖1A所示，exosomes具有特征性的盤狀結(jié)構(gòu)，直徑30～100 nm。

之前的研究表明CD63為exosomes表達(dá)的特異性高表達(dá)蛋白，為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們所提的囊泡為exosomes，而不是其他如凋亡小體、微囊泡等細(xì)胞分泌物，我們檢測了所提樣品的CD63蛋白的表達(dá)，如圖1B所示:與細(xì)胞相比，exosomes中富含CD63蛋白。

圖1 exosomes的鑒定

2.2 exosomes被細(xì)胞吞入的觀察將exosomes和細(xì)胞共培養(yǎng)，通過共聚焦顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察。如圖2所示，培養(yǎng)液中大部分exosomes可在3 h內(nèi)被細(xì)胞胞吞。

圖2 熒光顯微鏡下觀察exosomes被細(xì)胞胞吞

2.3 exosomes對肺癌細(xì)胞的順鉑敏感性的影響不同濃度的順鉑分別處理A549細(xì)胞和H1975細(xì)胞48 h后，與對照組比較，順鉑對這2種細(xì)胞的生長都有抑制作用，且呈濃度依賴性。3 μg/ml的順鉑處理組2種細(xì)胞的生存率都接近50%(圖3)。分別用未經(jīng)順鉑處理和經(jīng)順鉑處理的A549細(xì)胞和H1975細(xì)胞來源的exosomes對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，見圖4。與對照組相比，未經(jīng)順鉑處理的A549細(xì)胞來源的exosomes對細(xì)胞的順鉑敏感性沒有影響，而將順鉑處理的A549細(xì)胞來源的exosomes預(yù)處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞的存活率提高了大約24%;同樣的，與對照組相比，未經(jīng)順鉑處理的H1975細(xì)胞來源的exosomes對細(xì)胞的順鉑敏感性沒有影響，而將經(jīng)順鉑處理過H1975細(xì)胞來源的exosomes預(yù)處理細(xì)胞后，細(xì)胞的存活率提高了大約15%。

3 討論

圖3 不同濃度的順鉑處理48 h后肺癌細(xì)胞的存活率

圖4 順鉑處理的肺癌細(xì)胞來源的exosomes降低細(xì)胞對順鉑的敏感性

在順鉑處理下，肺癌細(xì)胞周圍的微環(huán)境發(fā)生了變化，細(xì)胞作出了相應(yīng)的變化來適應(yīng)周邊的環(huán)境，DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)和各種通路被激活，細(xì)胞存活率發(fā)生了改變，在濃度為3 μg/ml的順鉑刺激下，接近50%的肺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞和H1975細(xì)胞)內(nèi)的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)在被激活后，細(xì)胞內(nèi)的核苷酸損傷仍然不能修復(fù)，細(xì)胞不能順利進(jìn)入完整的細(xì)胞周期，遺傳信息不能進(jìn)行復(fù)制，細(xì)胞不能正常地進(jìn)行分裂，隨即，細(xì)胞進(jìn)入了凋亡或死亡程序。而其他細(xì)胞則通過修復(fù)等一系列通路的調(diào)整順利地存活下來了，其分泌的exosomes將釋放至細(xì)胞外并通過旁分泌方式傳遞到周圍同源細(xì)胞，被鄰近細(xì)胞以胞吞方式吞入，exosomes內(nèi)包裹的RNA和蛋白被釋放，通過調(diào)節(jié)下游通路從而影響受體細(xì)胞的生物學(xué)功能，受體細(xì)胞作出了相應(yīng)的改變，致使細(xì)胞對順鉑敏感性降低，當(dāng)再次用順鉑處理細(xì)胞時，順鉑對細(xì)胞的抑制率顯著降低。在本實(shí)驗(yàn)中，3 μg/ml的順鉑組肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1975的生存率都接近50%，由于對exosomes預(yù)處理，這個濃度下的細(xì)胞存活率可以有上升和下降的空間，便于實(shí)驗(yàn)觀察，因而我們選取3 μg/ml作為我們研究的順鉑濃度。

目前有研究顯示耐藥的前列腺癌細(xì)胞中可裝載與耐藥相關(guān)的信息，并且這些信息可以通過exosomes傳遞至非耐藥細(xì)胞中引起受體細(xì)胞敏感性降低［14］。exosomes可能通過介導(dǎo)miRNAs和mRNAs的傳遞影響A549細(xì)胞間的信息交流，從而改變受體細(xì)胞對藥物的敏感性［15］。本研究認(rèn)為在順鉑處理過程中肺癌細(xì)胞分泌的exosomes可裝載相關(guān)信息并將這些信息傳遞至其他同源細(xì)胞，從而降低細(xì)胞對順鉑的敏感性。當(dāng)然，這種對于exosomes引起細(xì)胞對藥物敏感性的解釋只是其中的一種，還有研究認(rèn)為耐藥的卵巢癌細(xì)胞可通過囊泡排出更多的順鉑從而降低細(xì)胞對順鉑的敏感性［16］，可能2種機(jī)制都參與了該藥物敏感性調(diào)節(jié)過程。

通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞在受到順鉑處理后可以向周圍微環(huán)境中分泌exosomes，而這些exosomes進(jìn)入受體肺癌細(xì)胞后能夠降低受體細(xì)胞對順鉑的敏感性，因此，是否可以通過阻斷此過程中exosomes的分泌和傳遞來減弱在順鉑治療肺癌中產(chǎn)生敏感性降低的現(xiàn)象，這為深入研究肺癌細(xì)胞對順鉑敏感性的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了一種新的思路。在未來非小細(xì)胞肺癌的治療中，針對exosomes的抑制劑與其他化療藥物的聯(lián)合治療可能成為研究的趨勢，這作為一種新的治療策略值得進(jìn)一步的研究。

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