薛曉婕

基因甲基化是抑癌基因失活的主要機(jī)制。胰腺癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)生隱匿，發(fā)展迅速，每年的平均發(fā)病率與平均死亡率相近，5年存活率不足5%。胰腺癌中許多抑癌基因因CpG島異常超甲基化而失活，甲基化CpG結(jié)合蛋白通過(guò)與組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)復(fù)合體相互作用而實(shí)現(xiàn)其抑制作用。甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄有賴于抑制性染色質(zhì)環(huán)境。HDAC-1過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致組蛋白去乙?；?。近年來(lái)，胰腺癌的輔助化療對(duì)緩解臨床癥狀，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間和提高生存質(zhì)量有相當(dāng)重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察HDAC的表達(dá)和TMS1/ASC啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的狀態(tài)研究吉西他濱(gemcitabine，GEM)治療胰腺癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;GEM購(gòu)自Sigma公司;胰腺癌細(xì)胞PANC-1購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);蛋白抽提試劑盒購(gòu)自Pierce公司;兔抗人HDAC-1多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;IgGHRP羊抗兔多克隆抗體購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司;HRP標(biāo)記的β-actin單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代:用0.25%的胰酶及0.02%的EDTA消化液消化PANC-1細(xì)胞，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)70%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸消化并傳代。

1.2.2 GEM對(duì)PANC-1胰腺癌細(xì)胞內(nèi)TMS1/ASC的誘導(dǎo):細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，取1×106/瓶傳代接種于2個(gè)裝有培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入4.27 μg/ml GEM繼續(xù)培養(yǎng)，未加入GEM的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.3 透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài):EP管中收獲細(xì)胞(5×106)，PBS洗滌2次。2%戊二醛固定樣品15 min后，4℃，二甲胂酸鈉緩沖液洗滌3次，15 min/次，接著1%鋨酸固定30 min。然后PBS洗滌2次，5 min/次，再進(jìn)行梯度脫水:20%、30%、50%、70%、90%乙醇分別于4℃下脫水2 min，100%乙醇室溫下脫水2 min，100%乙醇4℃下脫水2 min。室溫下滲透，丙酮:環(huán)氧樹(shù)脂(1∶1)作用60 min，100%樹(shù)脂作用60 min。37℃包埋12 h，60℃聚合48 h。在超薄切片機(jī)上先制成半薄切片，光鏡下定位再制成超薄切片，醋酸鈾染色10 min(避光)后，立即進(jìn)行載網(wǎng)檸檬酸鉛染10 min。然后用0.02 mol/L NaOH洗1次，雙蒸水洗2次，濾紙吸水后，將銅網(wǎng)置于鋪有濾紙的平皿中，半掩皿蓋，燈下烘干保存。電鏡下觀察并拍攝照片。

1.2.4 HDAC-1蛋白水平檢測(cè):提取各組細(xì)胞總蛋白。取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移2 h后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人HDAC-1多克隆抗體(1∶1000，Santa Cruz公司)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗(1∶2000)，室溫輕搖2 h，洗膜，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)液，暗室顯影、定影后掃描。以β-actin作為內(nèi)參照。

1.2.5 TMS1/ASC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè):按照DNA提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)說(shuō)明書提取細(xì)胞基因組DNA，進(jìn)行重亞硫酸鹽處理。具體步驟:取DNA約4 μg稀釋至50 μl，加入5.5 μl 3 mol/L的NaOH，37℃變性10 min。加入30 μl新配制的10 mmol/L的對(duì)苯二酚及520 μl 3 mol/L NaHSO3(以10 mol/L的NaOH調(diào)整pH值至5.0)，混勻，避光，置于50℃水浴16 h。應(yīng)用Wizard DNA純化試劑盒(Promega公司)純化修飾后的DNA。于室溫下加入5.5 μl 3 mol/L的NaOH，放置15 min。加入2 μl 10 mg/ml糖原，66 μl 10 mol/L乙酸銨及450 μl冰乙醇過(guò)夜，離心，洗滌，室溫下干燥，加60 μl TE(pH 8.0)溶解，-20℃保存。甲基化酶處理基因組DNA按照試劑說(shuō)明操作步驟進(jìn)行，使雙鏈DNA上的胞嘧啶全部甲基化。

1.2.6 結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)檢測(cè):以亞硫酸鹽修飾后的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系:樣品DNA 2 μl，10倍緩沖液5 μl，上下游引物各2 μl，dNTP 2.5 μl，F(xiàn)ast-Taq酶0.2 μl，去離子H20 36.3 μl。在Touchdown—PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95℃5 min，94℃30 s，68℃30 s，72℃30 s，2個(gè)循環(huán);94℃30 s，66℃30 s，72℃30 s，3個(gè)循環(huán);94℃30 s，64℃30 s，72℃30 s，4個(gè)循環(huán);94℃30 s，62℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)。以甲基化酶(SSSI)處理或未處理的正常人的外周血細(xì)胞DNA分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。取部分PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，Bio-Rad自動(dòng)成像儀成像。取部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行HhaI酶切，反應(yīng)體系:PCR產(chǎn)物10 μl，去離子H2O 18 μl，10倍緩沖液Tango 2 μl，Hhal 2 μl，酶切8 h后行聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，EB染色，攝片。Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，并計(jì)算甲基化率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GEM對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC-1形態(tài)的影響GEM刺激PANC-1 24 h后，電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡的形態(tài)學(xué)變化，絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生核質(zhì)疏松，核膜分層、起泡甚至破裂，核質(zhì)溢出，胞漿也出現(xiàn)空泡，細(xì)胞膜和細(xì)胞器明顯改變。見(jiàn)圖1。

2.2 GEM刺激胰腺癌細(xì)胞PANC-1中HDAC的表達(dá)與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)GEM誘導(dǎo)的PANC-1中HDAC表達(dá)顯著降低，并隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)不斷降低。見(jiàn)圖2。

2.3 TMS1/ASC基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)甲基化率(%)=lane2/(lane1+lane2)×100%，因產(chǎn)物被酶切為52、53bp，故酶切后為兩條帶。對(duì)照組和GEM處理組TMS1/ASC基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率分別為94.2%和17.3%，與GEM組比較，對(duì)照組TMS1/ASC基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率明顯升高(P＜0.01)。見(jiàn)圖3。

圖1 PANC-1細(xì)胞形態(tài)電鏡照片(×6000)

圖2 胰腺癌細(xì)胞PANC-1中HDAC的表達(dá)

圖3 5-雜氮-2'-脫氧胞苷處理前后胰腺癌PANC-1細(xì)胞株COBRA圖

3 討論

胰腺癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，進(jìn)展迅速，高度侵襲，化療是胰腺癌綜合治療中的重要輔助手段之一，對(duì)化療藥物的正確選擇將直接影響療效，加之胰腺癌化療極易出現(xiàn)耐藥，胰腺癌臨床治療面臨嚴(yán)峻的考驗(yàn)［1］。GEM作為一種脫氧胞苷類抗腫瘤藥物，對(duì)實(shí)體瘤具有良好的抗腫瘤活性［2-3］。目前已作為臨床惡性腫瘤化療的一線用藥。許多研究顯示，基因啟動(dòng)子區(qū)CPG島高甲基化可以導(dǎo)致抑癌基因靜息，引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。死亡區(qū)域(DDF)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和激活機(jī)制是目前一項(xiàng)熱門研究課題，TMSl/ASC基因包含有N—端PYD和C—端CARD結(jié)構(gòu)的蛋白［4］。包含這種結(jié)構(gòu)的TMS1/ASC基因編碼蛋白可能在調(diào)節(jié)凋亡和免疫應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵作用。因此，由啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化而導(dǎo)致TMS1/ASC基因沉默，甲基化CpG結(jié)合蛋白可以通過(guò)與HDAC復(fù)合體相互作用而實(shí)現(xiàn)其抑制作用可能對(duì)癌細(xì)胞逃避凋亡有利［5］。

本實(shí)驗(yàn)采用透射電鏡、蛋白印跡法和MSP技術(shù)，電鏡結(jié)果顯示，GEM刺激PANC-1 24 h后，其內(nèi)部形態(tài)發(fā)生劇烈改變，GEM具有顯著抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的作用。蛋白印跡法揭示HDAC在GEM誘導(dǎo)的胰腺癌PANC-1細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1中TMS1/ASC的啟動(dòng)子發(fā)生高頻率的甲基化，通過(guò)基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化導(dǎo)致TMS1/ASC沉默有利于胰腺癌細(xì)胞逃避凋亡，從而可能在胰腺癌的發(fā)生中起了一定的作用。GEM作為胰腺癌治療的一線藥物，可以通過(guò)抑制TMS1/ASC發(fā)生甲基化起到化療的效果，也可以通過(guò)監(jiān)測(cè)其甲基化的表達(dá)狀態(tài)來(lái)觀察化療耐藥情況，TMS1/ASC基因表達(dá)的下降可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性下降。HDAC-1表達(dá)沉默后可使DNA組蛋白處于乙?；癄顟B(tài)，使DNA易于解聚，染色質(zhì)呈轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)，有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA模板相結(jié)合，進(jìn)而激活一系列有關(guān)增殖凋亡調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化的抑癌基因［6］。GEM治療胰腺癌可能通過(guò)抑制TMS1/ASC甲基化和促進(jìn)組蛋白乙?；瘉?lái)發(fā)揮其化療的作用。

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