劉俊遠(yuǎn)，黃桂林，張玉婷

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤第三位[1]。在我國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[2]，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響。生長抑制因子4 (inhibitor of growth family member 4,ING4) 是近年來新發(fā)現(xiàn)的候選抑癌基因，在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。人表皮生長因子受體2 (caudal type homeobox transcription factor 2,HER2)是人類原癌基因之一，近年來其在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受到關(guān)注。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測ING4和HER2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，觀察ING4、HER2與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，初步探討其在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后判斷方面的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2007年1月—2008年4月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診為原發(fā)性結(jié)直腸癌患者99例，取其病理組織的石蠟標(biāo)本共99份作為結(jié)直腸癌組。99例患者中男51例，女48例;年齡30～85歲，平均(62.9±11.8)歲。其中結(jié)腸癌36例、直腸癌63例；高分化9例、中分化75例、低分化15例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例；T1期6例、T2期25例、T3期52例、T4期16例;TNM分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期37 例，Ⅳ期8 例。99例患者均行結(jié)直腸癌根治術(shù)治療，術(shù)前均未接受放療和化療，臨床及病理資料完整。術(shù)后采用電話及門診復(fù)查進(jìn)行隨訪，隨訪起點(diǎn)為確診之日，隨訪終點(diǎn)為患者出現(xiàn)死亡、失訪或至截止時(shí)間(2013-05-30)。隨訪結(jié)束時(shí)，獲得完整隨訪資料者87例，隨訪完成率為 87.9%，其中35例結(jié)直腸癌患者死亡。同時(shí)選擇30例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者距腫瘤>5 cm的癌旁正常組織作為對(duì)照組。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人ING4多克隆抗體(ab113425)購自美國abcam公司，兔抗人HER2單克隆抗體、Envision試劑盒及DBA試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法 石蠟包埋的結(jié)直腸癌標(biāo)本行4 μm厚連續(xù)切片，染色步驟嚴(yán)格按Envision試劑盒的操作說明進(jìn)行；ING4、HER2抗體均按1∶200稀釋，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判定 由2名高年資病理科醫(yī)師在雙盲情況下進(jìn)行染色評(píng)分。ING4陽性表達(dá)以細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為準(zhǔn)；使用半定量的評(píng)分系統(tǒng)來評(píng)估抗體的染色效果，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野或500個(gè)細(xì)胞。按染色強(qiáng)度計(jì)分:0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞數(shù)≤10%，2分為陽性細(xì)胞數(shù)11%～50%，3分為陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%，4分為陽性細(xì)胞數(shù)>75%；染色強(qiáng)度計(jì)分與陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分乘積：0～2分為(-)，3～5分為(+)，6～9分為(++),10～12分為(+++)。HER2以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色為陽性，染色結(jié)果分成4級(jí)：(-)為<10%細(xì)胞膜無著色或不連續(xù)的輕微著色,(+)為>10%細(xì)胞膜連續(xù)的輕至中度著色,(++)為>10%細(xì)胞膜連續(xù)的中度著色,(+++)為>10%細(xì)胞膜連續(xù)的強(qiáng)著色；(-)和(+)視為無或低表達(dá),(++)及(+++)視為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料的分析采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)性分析；采用Kaplan-Meier乘積極限法計(jì)算累計(jì)生存率并繪制生存曲線；采用log-rank檢驗(yàn)比較生存率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ING4、HER2在結(jié)直腸癌組和對(duì)照組中的表達(dá) ING4在結(jié)直腸癌組陽性表達(dá)率為68.7%(68/99，見圖1)，ING4在對(duì)照組陽性表達(dá)率為93.3%(28/30)，結(jié)直腸癌組ING4陽性表達(dá)率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.346，P<0.05)。HER2在結(jié)直腸癌組陽性表達(dá)率為35.4%(35/99，見圖1)，HER2在對(duì)照組陽性表達(dá)率為6.7%(2/30)，結(jié)直腸癌組HER2陽性表達(dá)率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.262，P<0.05)。

注：A為ING4的陽性表達(dá)，B為HER2的陽性表達(dá)

圖1 結(jié)直腸癌組織中ING4、HER2的陽性表達(dá)(免疫組化Envision法，×400)

Figure1 The positive expression of ING4，HER2 in the colorectal cancer

2.2 ING4、HER2的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 ING4的表達(dá)與浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TMN分期相關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。HER2的表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TMN分期相關(guān)(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位及分化程度無關(guān)(P> 0.05，見表1)。

表1 ING4、HER2表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

Table1 Relationship between expression of ING4，HER2 and clinicopathologic factors of colorectal cancer

例數(shù)ING4陽性表達(dá)χ2值P值HER2陽性表達(dá)χ2值P值性別 男5136(706)0177067420(392)06870407 女4832(667)15(313)年齡(歲) <603321(636)0587044412(364)00220882 ≥606647(712)23(348)腫瘤大小(cm) ≤55642(750)2389012221(375)02600610 >54326(605)14(326)腫瘤部位 結(jié)腸3623(639)0605043612(333)01010751 直腸6345(714)23(365)浸潤深度 T1+T23129(935)12970<00015(161)72980007 T3+T46839(574)30(441)分化程度 高分化98(889)1117700043(333)00570959 中分化7555(733)27(360) 低分化155(333)5(333)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無5744(772)4520003412(210)120230001 有4224(571)23(548)TMN分期 Ⅰ+Ⅱ5444(815)9042000310(185)14732<0001 Ⅲ+Ⅳ4524(533)25(556)

2.3 結(jié)直腸癌組ING4、HER2表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)直腸癌組ING4與HER2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.412，P<0.001，見表2)。

表2 ING4與HER2表達(dá)的相關(guān)性

Table2 Correlation between ING4 and HER2 expressions in colorectal cancer

ING4HER2+ -合計(jì)+155368-201131合計(jì)356499

2.4 結(jié)直腸癌組織中ING4、HER2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 ING4陰性者5年生存率為35.5%(11/31)，ING4陽性者5年生存率為77.9%(53/68)，兩組生存率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.721，P<0.001，見圖2)。HER2陰性者5年生存率為78.1%(50/64)，HER2陽性者5年生存率為40.0(14/35)，兩組生存率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.551，P<0.001，見圖3)。

圖2 結(jié)直腸癌組織中ING4的表達(dá)與5年生存率的關(guān)系

Figure2 The survival curve between ING4 positive group and ING4 negative group in the colorectal cancer

圖3 結(jié)直腸癌組織中HER2的表達(dá)與5年生存率的關(guān)系

Figure3 The survival curve between HER2 positive group and HER2 negative group in the colorectal cancer

3 討論

ING4屬于生長抑制因子家族，該家族與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修補(bǔ)及血管生成密切相關(guān)[3]。ING4廣泛參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)過程，Shiseki等[4]研究發(fā)現(xiàn)，ING4通過上調(diào)p53的轉(zhuǎn)錄活性，擾亂正常的細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞生長停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Shi等[5]發(fā)現(xiàn)，ING4可以與核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κb)結(jié)合，使白介素8(IL-8)表達(dá)水平下降，導(dǎo)致腫瘤血管生成減少。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)是組織細(xì)胞為適應(yīng)缺氧環(huán)境所產(chǎn)生的關(guān)鍵因子，Ozer等[6]研究發(fā)現(xiàn)，ING4能夠明顯抑制缺氧狀態(tài)下HIF靶基因(如Nip3、AK3等)的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。ING4在正常組織中表達(dá)豐富，在多種惡性腫瘤組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，其在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為54.5%[7]，在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率為63.3%[8]。本研究結(jié)直腸癌組織中ING4陽性表達(dá)率為68.7%，顯著低于對(duì)照組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。提示ING4低表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究顯示，ING4低表達(dá)與組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小及部位無關(guān)，提示ING4與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，并參與了腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，ING4陰性表達(dá)組的5年生存率明顯低于陽性表達(dá)組。提示ING4表達(dá)缺失的結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。

HER2 基因編碼一種分子量為 185 KD且具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白質(zhì)(P185HER2)，在細(xì)胞增殖分化、血管生成中發(fā)揮重要作用。HER2在乳腺癌及胃癌中的研究較多也較成熟，在乳腺癌中，針對(duì)HER2的靶向治療已在臨床上廣泛應(yīng)用。但近年來有關(guān)HER2與結(jié)直腸癌的相關(guān)研究結(jié)果存在較大差異。Park等[9]通過檢測137例結(jié)直腸癌標(biāo)本中HER2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HER2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)高于正常結(jié)直腸組織，且HER2高表達(dá)患者5年生存率明顯降低。吳愛國等[10]通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)大腸癌 HT29 細(xì)胞中HER2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖受到了明顯抑制。但Schuell等[11]發(fā)現(xiàn)HER2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)率低，與患者臨床病理資料無明顯相關(guān)性。結(jié)果差異較大可能由技術(shù)、抗體、結(jié)果判斷差異造成，本研究HER2蛋白在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率為35.4%,高于癌旁正常結(jié)直腸組織；且HER2表達(dá)水平和浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān)，HER2陽性表達(dá)組的5年生存率明顯低于陰性表達(dá)組，提示HER2表達(dá)增多，腫瘤的惡性程度增高，易發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后差。

有研究發(fā)現(xiàn)，ING4 基因與NF-кb的結(jié)合，除了影響IL-8的表達(dá)，還可以抑制 NF-κb調(diào)節(jié)基因COX-2、MMP-9等的轉(zhuǎn)錄[12]，這些基因在腫瘤血管生成及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。而Lanza-Jacoby等[13]在乳腺癌的研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)HER2對(duì)COX-2的表達(dá)具有決定性作用，COX-2的表達(dá)在HER2陽性的乳腺癌組織中明顯上升。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中ING4和HER2蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且二者均與預(yù)后有關(guān)，以上結(jié)果提示兩者可能在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中相互影響。兩者聯(lián)合檢測可作為評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌惡性程度和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。本研究仍存在樣本量小等不足，有待今后進(jìn)一步研究完善。

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