辛光大，秦少游，王江濱

非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是世界范圍內(nèi)分布的常見(jiàn)的慢性肝病，可進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌[1-4]。尋找NASH發(fā)生、發(fā)展的危險(xiǎn)因素，探討其防治策略是目前國(guó)內(nèi)外肝病學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，不同性別、不同年齡段人群NASH發(fā)生率有明顯差異[5]，并推測(cè)性激素種類(lèi)及其水平在NASH的性別差異中起重要作用，性別干預(yù)可能會(huì)對(duì)NASH的進(jìn)展產(chǎn)生影響，但目前的研究結(jié)論尚存在爭(zhēng)議。本研究通過(guò)建立蛋氨酸-膽堿缺乏(methionine-choline-deficient，MCD)飲食誘導(dǎo)C57BL/6雄性NASH小鼠模型[6]，觀(guān)察其血清性激素水平、肝臟病理組織學(xué)表現(xiàn)及相關(guān)生化指標(biāo)變化，旨在探討性激素對(duì)NASH小鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用14周齡C57BL/6雄性小鼠50只(購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，常規(guī)飼養(yǎng)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房，12 h光照和黑夜循環(huán)，溫度(22±2)℃，濕度50%～60%。采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只小鼠分為對(duì)照組、MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組、睪丸切除+雌激素組5組，每組10只。

1.2 方法 對(duì)照組和MCD組小鼠行假手術(shù)，睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組、睪丸切除+雌激素組小鼠行睪丸切除術(shù)，恢復(fù)2 d后，對(duì)照組小鼠飼喂MCD對(duì)照飲食(Research Diets公司生產(chǎn)，A02082003B)，其余4組小鼠飼喂MCD飲食(Research Diets公司生產(chǎn)，A02082002B)，建立MCD誘導(dǎo)C57BL/6雄性NASH小鼠模型，自由攝取水及食物。性別干預(yù)：睪丸切除+雄激素組小鼠皮下注射丙酸睪酮(5 mg·kg-1·d-1，溶于橄欖油，Sigma公司生產(chǎn)，T1875)，睪丸切除+雌激素組小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(0.5 mg·kg-1·d-1，溶于橄欖油，Sigma公司生產(chǎn)，E8515)。造模4周后所有小鼠禁食/水12 h，摘眼球取血，并頸椎脫臼處死。

1.3 觀(guān)察指標(biāo) (1)小鼠肝左葉固定部位取材，行HE染色及Masson染色觀(guān)察肝臟組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度；行鋨酸染色觀(guān)察肝細(xì)胞脂肪變性情況，采用Olympus攝像系統(tǒng)進(jìn)行觀(guān)察和攝片。(2)由兩人雙盲行病理組織學(xué)檢查，根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)絡(luò)病理工作組指南行非酒精性脂肪性肝病活動(dòng)度評(píng)分(NAFLD activity score，NAS)[7]：①肝細(xì)胞脂肪變?cè)u(píng)分：肝實(shí)質(zhì)內(nèi)脂肪變肝細(xì)胞占總細(xì)胞的比例<5%計(jì)0分；5%～33%計(jì)1分；34%～66%計(jì)2分；>66%計(jì)3分。②小葉內(nèi)炎癥評(píng)分：200倍光鏡下計(jì)數(shù)壞死灶，無(wú)計(jì)0分，<2個(gè)計(jì)1 分，2～4個(gè)計(jì)2分，>4個(gè)計(jì)3分。③肝細(xì)胞氣球樣變：無(wú)計(jì)0分，少見(jiàn)計(jì)1分，多見(jiàn)計(jì)2分。以上3項(xiàng)計(jì)分之和即為NAS總分。(3)血清睪酮、雌二醇、ALT、AST水平：所有小鼠摘眼球取血，置于離心管中，靜置待血液凝固后，3 000 r/min離心10 min，離心半徑為13.5 cm，取上清液，采用ELISA法測(cè)定血清睪酮、雌二醇水平(CSB-E05109m和CSB-E05098m試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cusabio公司)，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT、AST水平。

2 結(jié)果

2.1 染色結(jié)果及NAS總分 對(duì)照組小鼠肝組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)均正常；MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組、睪丸切除+雌激素組小鼠肝小葉各區(qū)肝細(xì)胞內(nèi)均有大量脂肪空泡，匯管區(qū)及小葉內(nèi)可見(jiàn)灶狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主，偶可見(jiàn)肝細(xì)胞氣球樣變，MCD組小鼠肝細(xì)胞脂肪變性及小葉內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)最明顯(見(jiàn)圖1)。5組小鼠NAS總分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.724，P=0.000)，其中MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組、睪丸切除+雌激素組NAS總分秩均值大于對(duì)照組，睪丸切除組、睪丸切除+雌激素組NAS總分秩均值小于MCD組，睪丸切除+雌激素組NAS總分秩均值小于睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.2 血清睪酮、雌二醇、ALT、AST水平 5組小鼠血清睪酮、雌二醇、ALT、AST水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。睪丸切除組和睪丸切除+雌激素組小鼠血清睪酮水平低于對(duì)照組、MCD組、睪丸切除+雄激素組，睪丸切除+雌激素組小鼠血清雌二醇水平高于對(duì)照組、MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組、睪丸切除+雌激素組小鼠血清ALT、AST水平高于對(duì)照組，睪丸切除組小鼠血清ALT、AST水平低于MCD組，睪丸切除+雌激素組小鼠血清ALT、AST水平低于MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表1 5組小鼠NAS總分比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與MCD組比較，△P<0.05；與睪丸切除組比較，▲P<0.05；與睪丸切除+雄激素組比較，☆P<0.05

Table2 Comparison of serum testosterone，estradiolin，ALT and AST in the five groups

組別例數(shù)睪酮(ng/ml)雌二醇(pmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)對(duì)照組10631±081 350±044 335±50 411±52 MCD組10635±060 350±037 1094±104? 1142±68? 睪丸切除組10018±004?△☆ 339±035 953±63?△ 1042±84?△ 睪丸切除+雄激素組10621±063 339±030 1022±104? 1103±77? 睪丸切除+雌激素組10018±005?△☆2185±217?△▲☆ 753±63?△▲☆ 821±58?△▲☆ F值3862910658214441930P值0000000000000000

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與MCD組比較，△P<0.05；與睪丸切除組比較，▲P<0.05；與睪丸切除+雄激素組比較，☆P<0.05

圖1 5組小鼠肝臟組織染色結(jié)果(×200)

3 討論

隨著肥胖癥及代謝綜合征在全球范圍內(nèi)的流行，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)迅速增長(zhǎng)并呈低齡化發(fā)病趨勢(shì)。NAFLD包括非酒精性單純性脂肪肝(NAFL)、NASH及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌，NASH是NAFL向肝硬化轉(zhuǎn)化的必經(jīng)階段，是隱源性肝硬化的重要原因之一。NASH預(yù)后不佳，部分患者可進(jìn)一步進(jìn)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌。尋找NASH發(fā)生、發(fā)展的危險(xiǎn)因素及阻斷其進(jìn)一步進(jìn)展的保護(hù)性因素，探討其防治策略是目前國(guó)內(nèi)外肝病學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一。

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，NASH在不同的年齡段人群具有不同的性別易感性，性激素種類(lèi)及其水平在NASH的性別差異中起重要作用，性別干預(yù)可能會(huì)對(duì)NASH的進(jìn)展產(chǎn)生影響，但目前的研究結(jié)論尚存在爭(zhēng)議。Tian等[8]對(duì)男性人群進(jìn)行的研究表明雄激素與NASH無(wú)關(guān)，而Mu等[9]和Zhang等[10]在大鼠動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)雄激素對(duì)NASH有保護(hù)作用。目前關(guān)于雌激素對(duì)NASH的作用還存在較多的爭(zhēng)議，Kamada等[11]認(rèn)為雌激素對(duì)NASH具有保護(hù)作用，而Kashireddy等[12]則認(rèn)為雌激素對(duì)NASH無(wú)明顯影響，還可能是促進(jìn)NASH進(jìn)展的因素[13]。由于上述實(shí)驗(yàn)研究是在不同的人群和/或動(dòng)物模型中進(jìn)行的，其發(fā)病機(jī)制不盡相同，因此所得結(jié)論也存在一定的局限性。

本研究觀(guān)察了性別干預(yù)對(duì)MCD飲食誘導(dǎo)C57BL/6雄性NASH小鼠的影響，研究結(jié)果顯示，睪丸切除組小鼠NAS總分秩均值小于MCD組，血清睪酮、ALT、AST水平均較MCD組降低，但睪丸切除+雄激素組小鼠與MCD組和睪丸切除組小鼠NAS總分秩均值，血清睪酮、ALT、AST水平間無(wú)差異，這與黃承飛等[14]研究結(jié)論不一致，其認(rèn)為雄激素對(duì)NASH具有保護(hù)作用，分析原因可能與研究所采用的動(dòng)物模型不同有關(guān)，提示雄激素在不同的NASH動(dòng)物模型中的作用途徑是不同的。值得注意的是，雄性小鼠去勢(shì)后NASH病情程度有所減輕，但補(bǔ)充雄激素后NASH病情程度卻無(wú)明顯加重，目前其確切作用機(jī)制尚不清楚，考慮是在MCD飲食誘導(dǎo)NASH小鼠模型中，雄激素可能通過(guò)肝細(xì)胞脂變、炎癥等多條途徑發(fā)揮作用，是多因素參與的。本研究結(jié)果還顯示，睪丸切除+雌激素組小鼠NAS總分秩均值小于MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組，血清ALT、AST水平均低于MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組，提示雌激素可改善MCD飲食誘導(dǎo)C57BL/6雄性NASH小鼠病情嚴(yán)重程度，但其具體作用機(jī)制較為復(fù)雜，同樣也是多因素參與的，需在今后的研究中進(jìn)一步深入分析NASH的性別差異及其機(jī)制，尋找NASH的保護(hù)性因素，不斷探討新的防治策略。

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