呼圣娟，姜榮興，師紅利，沈 皓，謝華紅

多肽pd20是本課題組在前期工作中篩選出的可特異性結(jié)合于胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞的新多肽分子，實(shí)驗(yàn)證實(shí)多肽pd20具有胃癌肝轉(zhuǎn)移的導(dǎo)向性[1-2]。為了探討此多肽是否具有攜帶抗癌藥物或抑癌基因靶向性治療胃癌肝轉(zhuǎn)移的作用，本研究前期工作已將多肽pd20與腫瘤壞死因子α(TNF-α)進(jìn)行了基因融合，并構(gòu)建了原核表達(dá)載體，對(duì)重組融合蛋白進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，此次實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍d20-TNF-α融合蛋白進(jìn)行純化，并對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行鑒定和生物學(xué)活性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 小鼠成纖維細(xì)胞L929購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞XGC9811-L由本實(shí)驗(yàn)組制備，保存于第四軍醫(yī)大學(xué)消化病研究所。

1.1.2 試劑和抗體類(lèi) Ni-NTA柱購(gòu)自QIAGEN公司；蛋白Marker購(gòu)自上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司；鼠抗人TNF-α單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、PE Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Matrigel膠均購(gòu)自BD公司。TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供。顯色試劑ABTS為Sigma 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 融合蛋白的純化和鑒定 將含融合基因pd20-TNF-α的大腸埃希菌BL21用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，13 000 r/min，離心半徑為6 cm，離心1 min，收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，按1 g菌體加7 ml裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，進(jìn)行超聲波裂菌。收集上清液用鎳柱進(jìn)行純化，具體步驟如下：(1)Equilibrium buffer平衡鎳柱；(2)將稀釋過(guò)濾后的溶菌上清液上樣；(3)Equilibrium buffer再洗5個(gè)床體積，使目標(biāo)蛋白充分掛柱；(4)Elution buffer 1洗去雜蛋白，收集洗雜峰；(5)Elution buffer 2進(jìn)行洗脫，并收集洗脫峰和洗脫液；(6)將收集的洗脫液用15 ml超濾離心管超濾濃縮，收集各次濃縮液合并后再次超濾濃縮，分裝備用；(7)各取1 ml過(guò)柱前、掛柱穿透、洗雜液、洗脫液進(jìn)行活性測(cè)定和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 。

1.2.2 SDS-PAGE及Western blotting檢測(cè) 將樣品進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)R250染色。將樣品蛋白用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，用鼠抗人TNF-α單克隆抗體為一抗，酶標(biāo)兔抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western blotting分析。

1.2.3 生物學(xué)活性測(cè)定 采用L929 細(xì)胞毒法檢測(cè)pd20-TNF-α融合蛋白的生物學(xué)活性，步驟如下：調(diào)整小鼠成纖維細(xì)胞L929的細(xì)胞密度為1.0×105細(xì)胞/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁80%以上。TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品起始濃度為100 U/ml，依次做4倍比梯度稀釋至終濃度6.25×10-3U/ml。樣品預(yù)稀釋起始濃度為100 U/ml，再做4倍比梯度稀釋?zhuān)K體積均為100 μl。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品每個(gè)劑量各測(cè)3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng)16 h。用結(jié)晶紫染色，測(cè)OD570 nm值，以稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，OD570 nm為縱坐標(biāo)做圖，以標(biāo)準(zhǔn)品的最低OD570 nm和最高OD570 nm之平均值做一平行于X軸的直線(xiàn)交于曲線(xiàn)，以樣品對(duì)應(yīng)曲線(xiàn)與該直線(xiàn)交點(diǎn)在X軸上讀出半效量的稀釋度，按以下公式計(jì)算樣品活性：樣品活性(U/ml)=標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)×(樣品預(yù)稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù))×(標(biāo)準(zhǔn)品半效量稀釋度/樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋度)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將胃癌細(xì)胞XGC9811-L調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106個(gè)/ml，培養(yǎng)至貼壁80%以上。融合蛋白起始濃度為100.00 U/ml(A組)，做4倍比梯度稀釋?zhuān)瑵舛纫来螢?5.00 U/ml(B組)、6.25 U/ml(C組)。對(duì)照組為不加融合蛋白的陰性對(duì)照組(D組)和流式細(xì)胞凋亡的KB組(E組)。分別將不同濃度的融合蛋白加入胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞XGC9811-L培養(yǎng)24 h。然后吸出至離心管內(nèi)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，加入胰酶進(jìn)行消化。吸除胰酶，用離心法收集各組細(xì)胞，取(5～10)×104個(gè)/ml用PBS重懸的細(xì)胞，離心后棄上清液，加入195 μl磷脂結(jié)合蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻。室溫避光孵育10 min。加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞早期凋亡率，即Annexin V-FITC陽(yáng)性細(xì)胞在總細(xì)胞數(shù)中的比例。每組設(shè)3個(gè)副孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值進(jìn)行分析。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將Millicell小室放入滅菌的24孔板中；在小室內(nèi)膜上加入Matrigel膠(100 μl/膜)，37 ℃ 4～5 h。用1%不完全培養(yǎng)液懸浮胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞XGC9811-L，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105細(xì)胞/ml，分別取200 μl與TNF-α(TNF-α組)、pd20-TNF-α(pd20-TNF-α組)各100 U在室溫下孵育1 h后加入小室內(nèi)，將只加入等量XGC9811-L細(xì)胞(XGC9811-L組)或?qū)φ针?對(duì)照肽組)作為對(duì)照。在下室中加入10%的完全培養(yǎng)液600 μl作為趨化劑用，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)20 h；取出小室，棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室中的細(xì)胞，95%甲醇固定15 min 后，取下濾膜；固定后的濾膜進(jìn)行Giemsa染色，中性樹(shù)膠封片，在40倍光鏡下計(jì)數(shù)膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)中間和四周共5個(gè)視野，每細(xì)胞計(jì)數(shù)3份，求出其平均值。相對(duì)侵襲指數(shù)=V2/V1×1，其中V2代表融合蛋白影響胃癌細(xì)胞的穿膜數(shù)，V1代表XGC9811-L組細(xì)胞的穿膜數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白的純化和鑒定 通過(guò)Ni-NTA柱純化，其中目的蛋白在咪唑濃度為200 mmol/L時(shí)得到濃集。電泳普帶掃描分析表明蛋白純度可達(dá)92%。經(jīng)Western blotting分析，純化的融合蛋白可以與抗TNF-α單抗相結(jié)合(見(jiàn)圖1)。

2.2 蛋白活性檢測(cè) 體外活性實(shí)驗(yàn)顯示：pd20-TNF-α融合蛋白對(duì)小鼠成纖維腺細(xì)胞L929的殺傷活性為7.6×106U/ml，標(biāo)準(zhǔn)品的殺傷活性為1×107(見(jiàn)圖2)。

2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將不同濃度的pd20-TNF-α融合蛋白作用于胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞XGC9811-L，A組細(xì)胞早期凋亡率為(9.04±0.08)%，B組為(6.96±1.21)%，C組為(5.99±0.02)%，D組為(0.73±0.02)%，E組為(0.01±0.00)%，各組細(xì)胞早期凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.57，P<0.05)；其中A組細(xì)胞早期凋亡率高于B組，B組亦高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為2.08和3.06；均P<0.01，見(jiàn)圖3)。

2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用Matrigel包被的Transwell小室觀(guān)察純化后的pd20-TNF-α融合蛋白對(duì)胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞XGC9811-L的體外侵襲能力的影響：pd20-TNF-α組、TNF-α組、XGC9811-L組、對(duì)照肽組單位時(shí)間內(nèi)的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(26.5±5.9)、(36.0±3.2)、(63.5±5.0)、(64.0±6.8)個(gè)，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.87，P<0.01)；其中pd20-TNF-α組、TNF-α組單位時(shí)間內(nèi)的穿膜細(xì)胞數(shù)少于XGC9811-L組(q值分別為19.5和14.6；均P<0.01)和對(duì)照組(q值分別為19.7和14.9；均P<0.01)；而pd20-TNF-α組與TNF-α組比較，XGC9811-L組與對(duì)照肽組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為4.25和0.75，均P>0.05，見(jiàn)圖4)。

注：MK為標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker；1為過(guò)柱前；2為掛柱穿透；3為洗雜液；4～8為洗脫液(咪唑濃度分別為50、100、200、500 mmol/L)；9為Western blotting 檢測(cè)

圖1 Ni-NTA柱純化結(jié)果

Figure1 The purification result of Ni-NTA

注：橫坐標(biāo)表示蛋白的稀釋度

圖2 pd20-TNF-α融合蛋白生物學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果

Figure2 The biological activity of fusion protein pd20-TNF-α

注：PI=碘化丙啶，Annexin V=磷脂結(jié)合蛋白V；A、B、C pd20-TNF-α融合蛋白的濃度分別為100.00、25.00、6.25 U/ml；D為陰性對(duì)照組，未添加藥物；E為流式細(xì)胞凋亡所使用的KB組；F為不同組的胃癌細(xì)胞早期凋亡率

圖3 胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞XGC9811-L凋亡實(shí)驗(yàn)

Figure3 Apoptosis test of high level hepatic metastasis from gastric cancer-related potential cell XGC9811-L

注：與XGC9811-L組比較，*P<0.01；與對(duì)照肽組比較，△P<0.01

圖4 各組胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞XGC9811-L相對(duì)侵襲指數(shù)比較

Figure4 Comparison of relative invasive indexes of high level hepatic metastasis from gastric cancer-related potential cell XGC9811-L among various groups

3 討論

TNF是一種由活化的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有多功能的炎性遞質(zhì)，是迄今為止人們發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子[3]。隨著20世紀(jì)80年代中期重組TNF-α的獲得，人們開(kāi)始探索TNF-α在腫瘤治療中的作用。近年發(fā)現(xiàn)，TNF-α對(duì)體外多種腫瘤細(xì)胞株包括胃癌細(xì)胞在內(nèi)有明顯的細(xì)胞毒性，但由于所用的治療劑量大，導(dǎo)致毒副作用嚴(yán)重[4-5]。因此，如何提高TNF-α的治療作用，降低其毒副作用成為T(mén)NF-α能否作為抗腫瘤藥物的關(guān)鍵性問(wèn)題。

分子靶向治療是近年來(lái)在治療血液病和實(shí)體腫瘤中涌現(xiàn)出的新的治療手段[6-7]，其關(guān)鍵是要找到具有腫瘤導(dǎo)向性的靶向載體，以攜帶抗癌藥物或抑癌基因起到全身用藥、局部發(fā)揮的作用，減少毒副作用的發(fā)生[8]。多肽pd20是本課題組在前期工作中篩選出的可與胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞及胃癌肝轉(zhuǎn)移組織相結(jié)合，并在裸鼠體內(nèi)可歸巢于胃癌肝轉(zhuǎn)移組織，具有胃癌肝轉(zhuǎn)移導(dǎo)向性的新多肽分子[1-2]。為了提高TNF-α在癌組織中的有效治療濃度并避免進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)引起嚴(yán)重毒副作用，本研究前期工作中已將胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞導(dǎo)向肽pd20與TNF-α進(jìn)行了基因融合，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，此次實(shí)驗(yàn)的目的是對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化并對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性檢測(cè)。

鎳柱組氨酸標(biāo)簽親和層析純化試劑盒是被公認(rèn)的高效的蛋白純化系統(tǒng)[9]，其純化標(biāo)簽為6個(gè)組氨酸，每個(gè)組氨酸含有一個(gè)咪唑基團(tuán)，這個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)帶有很多額外電子，可親和鎳、鋅、鈷等金屬離子，在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白與鎳柱結(jié)合，在低pH下用咪唑競(jìng)爭(zhēng)洗脫。本研究中表達(dá)載體pet28a(+)帶有his標(biāo)簽，這個(gè)標(biāo)簽在pH 8.0時(shí)不帶電，且無(wú)免疫原性，對(duì)蛋白質(zhì)的分泌、折疊基本上無(wú)影響，可高度親和鎳離子，使融合蛋白進(jìn)行鎳柱純化成為可能。TNF-α有157 個(gè)氨基酸殘基，約17 kD，沒(méi)有糖基化，分子內(nèi)有一個(gè)二硫鍵，對(duì)維持其空間結(jié)構(gòu)有意義。故本研究中用不同濃度的咪唑洗脫pd20-TNF-α融合蛋白時(shí)，在其中加入少量的蛋白酶抑制劑，這既有利于洗脫，也會(huì)避免標(biāo)簽被折疊進(jìn)二級(jí)結(jié)構(gòu)里[10]。結(jié)果顯示，在咪唑濃度200 mmol/L時(shí)得到條帶單一的濃集蛋白，經(jīng)檢測(cè)其純度可達(dá)92%，并具有與抗TNF-α單抗結(jié)合的能力。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證純化后的融合蛋白是否具有TNF-α的殺傷活力，本研究先對(duì)融合蛋白進(jìn)行了體外活性檢測(cè)，純化得到的目的蛋白pd20-TNF-α殺傷活性為7.6×106U/ml，證實(shí)了融合蛋白兼有TNF-α的殺傷活性。多肽pd20是具有胃癌肝臟導(dǎo)向性的多肽分子，在凋亡實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)中選擇了胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞XGC9811-L，觀(guān)察融合蛋白pd20-TNF-α是否會(huì)對(duì)此細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力產(chǎn)生影響。結(jié)果顯示：融合蛋白pd20-TNF-α具有促進(jìn)胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞凋亡和抑制胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞侵襲的能力，間接證實(shí)了融合蛋白pd20-TNF-α可能兼有胃癌肝轉(zhuǎn)移的導(dǎo)向性，為下一步裸鼠體內(nèi)鑒定實(shí)驗(yàn)和開(kāi)發(fā)抗胃癌肝轉(zhuǎn)移新的靶向藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 Hu S，Guo X，Hie H，et al.Phage display selection of peptides that inhibit metastatic ability of gastric cancer cells with high liver-metastatic potential[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，341(4)：964-972.

2 呼圣娟，郭新寧，趙進(jìn)，等.胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞噬菌體結(jié)合肽的特異性鑒定[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2005，13(2)：158-160.

3 Van Ostade X，Vandenabeele P，Everaerdt B，et al.Human TNF mutants with selective activity on the p55 receptor [J].Nature，1993，361(6409)：266-269.

4 Mao W，Zhu X，Tang D，et al.TNF-α expression in the UCB-MSCs as stable source inhibits gastric cancers growth in nude mice[J].Cancer Invest，2012，30(6)：463-472.

5 Shaw J，Chen B，Huang WH，et al.The small-molecule TNF-alpha modulator，UTL-5g，reduces side effects induced by cisplatin and enhances the therapeutic effect of cisplatin in vivo[J].J Exp Ther Oncol，2011，9(2)：129-137.

6 Fulda S.Molecular targeted therapies for rhabdomyosarcoma：focus on hedgehog and apoptosis signaling[J].Klin Padiatr，2013，3(2)：76-79.

7 Lin ZK，Zhang R，Ge Z，et al.Characteristics of 4 specific target antigens in adult acute lymphoblastic leukemia[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2013，21(2)：289-295.

8 Almhanna K.Targeted therapy for gastric adenocarcinma[J].Adv Pharmacol，2012，65：437-470.

9 Schafer F，R?mer U，Emmerlich M，et al.Automated high-throughput purification of 6xHis-tagged proteins[J].J Biomol Tech，2002，13(3)：131-142.

10 Tropea JE，Cherry S，Nallamsetty S，et al.A generic method for the production of recombinant proteins in Escherichia coli using a dual hexahistidine-maltose-binding protein affinity tag[J].Methods Mol Biol，2007，363：1-19.