何春華，張 建，鄒 霓

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren′s syndrome，pSS)是一種主要累及外分泌腺體，發(fā)病基礎(chǔ)是免疫功能紊亂，T、B淋巴細(xì)胞活化增殖，產(chǎn)生大量免疫球蛋白和自身抗體的慢性系統(tǒng)性自身免疫病?？赏瑫r出現(xiàn)腎臟、肺臟、甲狀腺和肝臟等多種器官受累，部分患者可向惡性淋巴瘤發(fā)展。人白介素(IL)-7屬于促紅細(xì)胞生成素家族Ⅰ型短鏈細(xì)胞因子，由152個氨基酸殘基組成，是一種促進(jìn)淋巴細(xì)胞生成的細(xì)胞因子。實驗證實IL-7可通過刺激T細(xì)胞增殖、分化，維持T細(xì)胞存活，誘導(dǎo)單核細(xì)胞和B細(xì)胞的活化而對淋巴細(xì)胞發(fā)揮著重要作用[1-2]。目前IL-7在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[3]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)[4]發(fā)病中的作用已有較多報道。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測pSS患者唇腺組織中IL-7的表達(dá)水平，探討IL-7在pSS發(fā)病機(jī)制中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2005年3月—2012年10月濱州市人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診及住院的pSS患者30例為pSS組，均符合2002年干燥綜合征(SS)歐洲分類標(biāo)準(zhǔn)。其中男2例，女28例；年齡34～70歲，平均(44±19)歲；病程4個月～13年。另選擇同時期頜面部創(chuàng)傷和唇腺囊腫患者5例為對照組，其中男1例，女4例；年齡23～53歲，平均(43±17)歲。兩組性別及年齡均具有均衡性。

1.2 主要試劑 兔抗人IL-7單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)及SP免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測唇腺組織中IL-7的表達(dá) 唇腺石蠟組織切片常規(guī)脫蠟，過無水乙醇，3%過氧化氫室溫下作用10 min；水化后，以pH 6.0的1 nmol/L 檸檬酸鈉微波熱修復(fù)，加封閉血清后，分別加入4 ℃濕盒過夜，再加入鏈霉卵白素標(biāo)記的羊抗兔IgG，置濕盒中室溫30 min，而后加入與生物素結(jié)合的辣根過氧化物酶，室溫30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色2 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。鏡下觀察胞質(zhì)有棕黃色顆粒沉著者為陽性。切片在400倍顯微鏡下隨機(jī)選擇10個視野(每個視野計數(shù)100個細(xì)胞)，計算陽性著色細(xì)胞數(shù)百分比，最后求其均值。表達(dá)強(qiáng)度采用半定量方法進(jìn)行評價，標(biāo)準(zhǔn)為：-(沒有表達(dá))，+(1%～25%)，+ +(26%～50%)，+ + +(50%以上)。

1.4 HE染色法檢測唇腺組織中淋巴細(xì)胞浸潤情況 按Chisholm標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級：Ⅰ級：1個淋巴細(xì)胞浸潤灶/4 mm2；Ⅱ級：2個淋巴細(xì)胞浸潤灶/4 mm2；Ⅲ級：3個淋巴細(xì)胞浸潤灶/4 mm2；Ⅳ級：4個及以上淋巴細(xì)胞浸潤灶/4 mm2。

1.5 血清指標(biāo)檢測

1.5.1 采血 抽取pSS患者及對照組靜脈血8 ml，離心分離血清，置-70 ℃冰箱凍存待測。

1.5.2 自身抗體檢測 間接免疫熒光法檢測血清抗核抗體：滴加磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋待檢血清標(biāo)本為1∶20，吸取20 μl加于Hep-2細(xì)胞片上，標(biāo)本片置于室溫下孵育30 min，玻片置于玻片架上，PBS沖洗2次，各玻片滴加20 μl熒光標(biāo)記的抗人IgG抗體，將玻片置于室溫下孵育30 min，PBS沖洗，滴加20 μl甘油/PBS，蓋玻片覆蓋，熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果判斷：熒光顯微鏡下細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光為陽性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性，抗原片中出現(xiàn)陽性染色細(xì)胞為抗核抗體(ANA)陽性，否則為陰性。免疫印跡法檢測抗SSA抗體、抗SSB抗體，操作方法嚴(yán)格按產(chǎn)品操作說明書進(jìn)行。

1.5.3 紅細(xì)胞沉降率(ESR)檢測 pSS患者及對照組靜脈血約2 ml，采用魏氏法檢測，將靜脈血與枸櫞酸鈉按4∶1混合，加入魏氏管，記錄ESR。

1.5.4 C反應(yīng)蛋白(CRP)及免疫球蛋白檢測 pSS患者及對照組靜脈血約2 ml，運(yùn)用免疫比濁法檢測，將各標(biāo)本置于全自動特種蛋白分析儀上，按儀器操作說明嚴(yán)格進(jìn)行，記錄CRP、IgG、IgM、IgA結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 實驗室指標(biāo)結(jié)果 30例pSS患者中26例(87%)ANA為陽性，23例(77%)抗SSA抗體陽性、11例(37%)抗SSB抗體陽性。ESR(39±32)mm/h，CRP(14±11)mg/L，IgG(25±11)g/L，IgM(2.3±1.9)g/L，IgA(3.8±1.6)g/L。

2.2 IL-7免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 IL-7陽性產(chǎn)物定位于胞質(zhì)，呈棕黃色，主要表達(dá)于導(dǎo)管、腺泡上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤灶(見圖1)。pSS組29例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為97%,對照組1例呈陽性表達(dá)，兩組IL-7陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.013，見表1)。

2.3 HE染色結(jié)果 pSS唇腺組織中腺泡小葉及導(dǎo)管周圍灶性淋巴細(xì)胞浸潤(1個灶：>50個淋巴細(xì)胞/4 mm2)，腺泡破壞，萎縮，導(dǎo)管擴(kuò)張，纖維結(jié)締組織增生，脂肪浸潤(見圖2)。

2.4 IL-7陽性細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞浸潤灶數(shù)相關(guān)性分析 pSS患者唇腺組織的IL-7陽性細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞浸潤灶數(shù)呈正相關(guān)(r=0.807，P<0.01，見表2)。

2.5 IL-7陽性細(xì)胞數(shù)與實驗室指標(biāo)相關(guān)性分析 pSS患者唇腺組織的IL-7陽性細(xì)胞數(shù)與ESR呈正相關(guān)(P<0.01)，與其他實驗室指標(biāo)無相關(guān)性(P>0.05，見表3)。

3 討論

pSS患者唇腺組織破壞的具體機(jī)制至今尚未完全闡明，近年研究表明，免疫及炎性相關(guān)因素在pSS的發(fā)病過程中起了重要作用，而由活化的免疫細(xì)胞和一些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的炎性相關(guān)因子具有極為廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)方面發(fā)揮了重要作用[5]。近期國外研究證實，白介素家族中的IL-7及其受體(IL-7R)在pSS患者唇腺組織及血清中存在高表達(dá)，介導(dǎo)了疾病的發(fā)生與發(fā)展，與pSS關(guān)系密切，在SS的發(fā)病中起到重要作用，是當(dāng)前研究較為活躍的領(lǐng)域[6]。

圖1 IL-7高表達(dá)于pSS唇腺組織導(dǎo)管上皮細(xì)胞、腺泡上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤區(qū)(免疫組織化學(xué)法，×400)

Figure1 High expression of IL-7 in pSS labial gland tissue ductal epithelial cells,acinar epithelial cells and lymphocytes infiltration area

圖2 pSS患者唇腺組織中淋巴細(xì)胞浸潤情況(HE，×400)

Figure2 Lymphocyte infiltration in labial gland tissues in pSS patients with HE staining

表1 兩組IL-7表達(dá)情況(例)

表2 IL-7陽性細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞浸潤灶數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果(例)

Table2 Relationship between lymphocytic infiltration focus and the the positive cells of IL-7

淋巴細(xì)胞浸潤灶數(shù)例數(shù)IL-7 - + ++ +++Ⅰ級21100Ⅱ級30300Ⅲ級100262Ⅳ級1500312

表3 IL-7陽性細(xì)胞數(shù)與實驗室指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果

Table3 Analysis of the correlation between the positive cells of IL-7 and laboratory indexes

ESRCRPIgGIgMIgAr值 05460217032101390191P值<0010259005603430317

注：ESR=紅細(xì)胞沉降率，CRP=C反應(yīng)蛋白

IL-7是Namen等在1988年發(fā)現(xiàn)的主要由胸腺和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的相對分子質(zhì)量為25 000～28 000的糖蛋白，其由152個氨基酸殘基組成，編碼基因位于8q12-13，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子。研究發(fā)現(xiàn)，IL-7通過誘導(dǎo)T細(xì)胞相關(guān)受體的表達(dá)而介導(dǎo)了Th1和Th17細(xì)胞的分化，從而增加了IL-2、IL-17、IL-22等相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，而這幾種細(xì)胞因子又是導(dǎo)致SS發(fā)病的重要炎性因子,阻斷IL-7R能明顯降低Th1和Th17細(xì)胞的活性，從而降低相關(guān)炎性因子的表達(dá)[7]。Katsifis等[8]采用免疫組織化學(xué)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等方法對確診pSS患者及對照組人群進(jìn)行比較后證實：pSS患者涎腺組織中IL-17及相關(guān)因子的表達(dá)與炎性反應(yīng)的程度及臨床表現(xiàn)相關(guān)。Gonzalez-Quintial等[9]發(fā)現(xiàn)，在SLE小鼠模型中，隨著成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞的增殖IL-7表達(dá)亦增加，并促進(jìn)自身反應(yīng)性T細(xì)胞增殖及自身免疫性疾病的進(jìn)展，即使是在疾病的進(jìn)展期，應(yīng)用IL-7R拮抗劑仍可抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞活性并遏制疾病發(fā)展。這表明調(diào)節(jié)IL-7的平衡或許可成為一種治療或緩解自身免疫性疾病的方法。IL-7R+T細(xì)胞參與了SS患者唇腺組織增強(qiáng)的炎性反應(yīng)，尤其與IL-7的表達(dá)增高有關(guān)[10]。Nguyen等[11]在非易患SS的C57BL/6J小鼠(6～8周齡和15～17周齡)涎腺組織中注入表達(dá)IL-17A的血清5型腺病毒載體，制成SS樣的動物模型，最終發(fā)現(xiàn)了淋巴細(xì)胞的浸潤、細(xì)胞因子水平升高及涎液流量降低等改變，進(jìn)而表明IL-17A是涎腺功能受損的重要炎性因子,抗IL-17的靶向治療可能對改善腺體功能有效[12]。IL-7Rα抗體通過抑制IL-7R功能阻斷了IL-7/IL-7R/Th17之間的信號傳導(dǎo)，減少了相關(guān)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而阻斷了炎性反應(yīng)過程，因此通過改變調(diào)節(jié)IL-17細(xì)胞增殖分化的上位細(xì)胞因子IL-7/IL-7R可能為治療SS及其他自身免疫性疾病提供有效的新思路。Quartuccio等[13]研究證實人B淋巴細(xì)胞刺激因子(BlyS)與SS患者的免疫學(xué)指標(biāo)、B細(xì)胞病理性克隆、疾病活動度及B細(xì)胞淋巴瘤關(guān)系密切，指出BlyS在SS發(fā)病中具有重要作用。在風(fēng)濕性疾病的炎性組織中，巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DC)和成纖維細(xì)胞均可分泌IL-7，伴隨IL-7高表達(dá)的有T細(xì)胞分化刺激因子、炎性趨化因子、黏附因子等及異位淋巴樣聚集體形成，提示IL-7是重要的促炎性遞質(zhì)。IL-7既可通過自身對T、B淋巴細(xì)胞作用的調(diào)節(jié)發(fā)揮其在SS中的重要作用，還可通過誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)其效應(yīng)，以上研究結(jié)果都顯示炎性相關(guān)因子在風(fēng)濕性疾病中的重要作用[14]。故以IL-7/IL-7R為治療靶點在風(fēng)濕性疾病的治療中具有重要意義。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測了IL-7在pSS患者及對照者唇腺組織中的表達(dá)，并分析了其與唇腺組織中淋巴細(xì)胞浸潤及其他實驗室指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果顯示，pSS患者唇腺組織中有IL-7高表達(dá)及大量的淋巴細(xì)胞浸潤，而對照組低表達(dá)，并且IL-7陽性細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞浸潤灶數(shù)呈正相關(guān)，表明唇腺組織有無淋巴細(xì)胞浸潤影響IL-7是否表達(dá)及表達(dá)量，而表達(dá)的IL-7反過來也對浸潤的淋巴細(xì)胞的發(fā)育、增殖起到重要的作用，證實IL-7參與了pSS炎癥損傷的過程。同時也發(fā)現(xiàn)了IL-7在pSS唇腺組織表達(dá)的特點，即IL-7高表達(dá)于導(dǎo)管、腺泡上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤區(qū)，且呈胞質(zhì)表達(dá)，提示其與導(dǎo)管上皮細(xì)胞、腺泡細(xì)胞及浸潤的淋巴細(xì)胞關(guān)系密切，在pSS發(fā)病中發(fā)揮重要作用，與已知的IL-7可通過刺激T細(xì)胞增殖、分化，維持T細(xì)胞存活，誘導(dǎo)單核細(xì)胞和B細(xì)胞的活化而對淋巴細(xì)胞發(fā)揮重要作用的功效相吻合。

ESR是反映體內(nèi)炎癥活動的指標(biāo)之一，本研究證實IL-7陽性細(xì)胞數(shù)與ESR呈正相關(guān)，提示IL-7的表達(dá)水平與pSS的急性炎癥密切相關(guān)。但是本研究未發(fā)現(xiàn)與pSS活動程度密切相關(guān)的其他實驗室指標(biāo)如血清免疫球蛋白水平的關(guān)系，可能與兩者所介導(dǎo)的炎癥不同階段有關(guān)，可在今后的研究中進(jìn)一步證實。

唇腺組織中淋巴細(xì)胞的聚集通常作為pSS診斷的一個重要組織學(xué)指標(biāo)，但由于取材、染色等各因素及在實際操作中存在靈敏度或特異度不夠強(qiáng)的缺點，可能影響診斷結(jié)果。

總之，本研究結(jié)果提示IL-7在pSS的發(fā)病中起到重要的作用，但由于實驗條件所限，本研究未涉及pSS患者血清組織內(nèi)IL-7表達(dá)情況，因此進(jìn)一步明確其在血清內(nèi)的表達(dá)情況，可能會為進(jìn)一步探討其在pSS具體作用機(jī)制以及與其他免疫細(xì)胞的相互作用提供實驗基礎(chǔ)，有可能對早期阻止病情進(jìn)展，為治療該類疾病提供新的思路。另外，pSS唇腺組織檢測到IL-7的高表達(dá),為以后將唇腺組織的IL-7檢測作為SS的一個輔助診斷手段提供了初步的實驗基礎(chǔ)。

1 Liang B,Hara T,Wagatsuma K,et al.Role of hepatocyte-derived IL-7 in maintenance of intrahepatic NKT cells and T cells and development of B cells in fetal liver[J].J Immunol，2012，189(9):4444-4450.

2 Sammicheli S,Ruffin N,Lantto R,et al.IL-7 modulates B cells survival and activation by inducing BAFF and CD70expression in T cells[J].J Autoimmun，2012，38(4):304-314.

3 Deshpande P,Cavanagh MM,Le Saux S,et al.IL-7-and IL-15-mediated TCR sensitization enables T cell responses to self-antigens[J].J Immunol，2013，190(4):1416-1423.

4 Badot V,Luijten RK,van Roon JA,et al.Serum soluble interleukin 7 receptor is strongly associated with lupus nephritis in patients with systemic lupus erythematosus[J].Ann Rheum Dis，2013，72(3):453-456.

5 Youinou P,Saraux A,Pers JO.B-lymphocytes govern the pathogenesis of Sj?gren′s syndrome[J].Curr Pharm Biotechnol，2012,13(10):2071-2077.

6 Bikker A,van Woerkom JM,Kruize AA,et al.Increased expression of interleukin-7 in labial salivary glands of patients with primary Sj?gren′s syndrome correlates with increased inflammation[J].Arthritis Rheum，2010，62(4):969-977.

7 Bikker A,Moret FM,Kruize AA,et al.IL-7 drives Th1 and Th17 cytokine production in patients with primary SS despite an increase in CD4 T cells lacking the IL-7Rα[J].Rheumatology (Oxford),2012,51(6):996-1005.

8 Katsifis GE,Rekka S,Moutsopoulos NM,et al.Systemic and local interleukin-17 and linked cytokines associated with Sj?gren′s syndrome immunopathogenesis[J].Am J Pathol，2009，175(3):1167-1177.

9 Gonzalez-Quintial R，Lawson BR，Scatizzi JC，et al.Systemic autoimmunity and lymphoproliferation are associated with excess IL-7 and inhibited by IL-7Ra blockade[J].PLoS One，2011，6(11)：e27528.

10 Bikker A,Kruize AA,Wenting M,et al.IL-7 receptor effector T cells are increased in the inflamed salivary glands of pSS patients and correlate with inflammatory markers[J].Ann Rheum Dis,2011,70:A51.

11 Nguyen CQ,Yin H,Lee BH,et al.Pathogenic effect of interleukin-17A in induction of Sj?gren′s syndrome-like disease using adenovirus-mediated gene transfer[J].Arthritis Res Ther,2010,12(6):R220.

12 Nguyen CQ,Yin H,Lee BH,et al.IL17:potential therapeutic target in Sj?gren′s syndrome using adenovirus-mediated gene transfer[J].Lab Invest，2011,91(1):54-62.

13 Quartuccio L,Salvin S,Fabris M.BLyS upregulation in Sj?gren′s syndrome associated with lymphoproliferative disorders,higher ESSDAI score and B-cell clonal expansion in the salivary glands[J].Rheumatology (Oxford)，2013，52(2):276-281.

14 Bikker A，Hack CE，Lafeber FP，et al.Interleukin-7：a key mediator in T cell-driven autoimmunity，inflammation，and tissue destruction[J].Curr Pharm Des，2012，18(16)：2347-2356.