趙君玫，張 娜，王建新，沈曉君，劉學(xué)芳

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是心血管系統(tǒng)最常見的疾病之一，是多種心血管系統(tǒng)疾病主要的病理基礎(chǔ)，糖尿病、脂代謝紊亂、高同型半胱氨酸血癥等獨(dú)立的心血管危險(xiǎn)因素也被證明部分通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)而誘發(fā)AS[1-4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器之一，在蛋白質(zhì)的翻譯和加工修飾方面發(fā)揮著重要功效，病理情況下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊負(fù)荷以及處理該負(fù)荷能力之間的不平衡導(dǎo)致了ERS，ERS參與AS發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程[5-6]。免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(binding immunoglobulin protein，BIP)，也稱GRP78，是ERS反應(yīng)途徑中的重要分子伴侶，屬于熱休克蛋白(HSP70)家族成員之一，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的許多蛋白都有短暫的接觸作用，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的靈敏感應(yīng)器[7]。

臨床研究顯示，葛根通脈飲對(duì)AS及其所致的心腦血管疾病有一定的治療作用，為進(jìn)一步揭示該中藥在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，本研究以ERS信號(hào)通路中BIP為切入點(diǎn)，通過(guò)高膽固醇、蛋氨酸飲食建立兔高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的AS模型，觀察葛根通脈飲對(duì)同型半胱氨酸(Hcy)誘導(dǎo)的兔AS模型的ERS信號(hào)通路BIP mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討其可能存在的延緩或治療AS的作用，為葛根通脈飲抗AS藥理學(xué)作用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康日本大耳白兔32只，雄性，普通級(jí)，5月齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由河南康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0001。

試劑：葛根通脈飲(主要成分為葛根、山楂、太子參、當(dāng)歸尾、淫羊藿、赤芍、川芎和甘草)，由河南中醫(yī)學(xué)院制劑室制備。Hcy(Sigma公司產(chǎn)品，25 g /瓶，純度≥98%，批號(hào)：C-7352)。BIP原位雜交檢測(cè)試劑盒(批號(hào)MK3679-rabbit，武漢博士德生物工程有限公司)；BIP：批號(hào)3158-1，分子量為78 kD(北京前景科創(chuàng)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。HRP標(biāo)記抗鼠二抗：bs0296G-HRP，Lot：130916。HRP標(biāo)記抗兔二抗：bs0295G-HRP，Lot：019997。BIP地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針，按 BIP-mRNA 序列，rabbit BIP靶基因的mRNA序列為：(1)5′-GAAAA GAAAA CTAAA CCTTA CATTC AAGTT GACAT-3′；(2)5′-CAGCG TGTCA TGGAG CACTT CATCA AGCTC TACAA-3′；(3)5′-AGGA TTCTG ATTTG AAGAA GTCTG ACATT GATGA-3′；武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 制備AS動(dòng)物模型 將白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、葛根通脈飲低劑量組(葛低組)、葛根通脈飲高劑量組(葛高組)，每組8只。正常組飼喂基礎(chǔ)飼料；模型組飼喂高膽固醇飼料(在基礎(chǔ)飼料中加入1%膽固醇及0.02%蛋氨酸)；葛低組(葛根通脈飲5 g·kg-1·d-1+高膽固醇飼料)；葛高組(葛根通脈飲10 g·kg-1·d-1+高膽固醇飼料)。每日每只兔定量給予飼料，待各組兔吃光后再給予基礎(chǔ)飼料。各組兔均自由飲水，連續(xù)飼喂9周，復(fù)制AS模型。飼喂9周后開胸快速截取胸主動(dòng)脈上段，置4%多聚甲醛和液氮罐中(-196 ℃) 中保存。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 取兔胸主動(dòng)脈上段(4%多聚甲醛固定)，按照常規(guī)步驟進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片，采用蘇木素-伊紅(HE)染色的方法對(duì)組織進(jìn)行觀察，記錄結(jié)果。

1.2.3 組織原位雜交檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)BIP mRNA表達(dá) 取兔胸主動(dòng)脈上段(4%多聚甲醛固定)，按常規(guī)步驟進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片。參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行原位雜交：(1)滅活內(nèi)源性酶，滴加30%過(guò)氧化氫(H2O2)1份+蒸餾水10份混合，室溫處理10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗滌3次。(2)暴露mRNA核酸片段，切片滴加1 μg/ml蛋白酶K溶液〔100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8.0配制〕，37 ℃孵育10 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，30 min/次。蒸餾水洗滌1次。(3)后固定，1%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(pH 7.4)，含有1/1 000焦磷酸二乙酯(DEPC)，室溫固定10 min，蒸餾水洗滌3次。(4)預(yù)雜交，每張切片加20 μl預(yù)雜交液，恒溫箱38～42 ℃ 2～4 h。(5)雜交，每張切片加20 μl DNA探針/雜交液。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上，切片放入烤箱中70 ℃，10 min使RNA變性，然后放入恒溫箱38～42 ℃雜交過(guò)夜。雜交后洗滌。滴加蛋白封閉緩沖液，37 ℃ 30 min。滴加1滴兔抗地高辛-BSA，37 ℃ 60 min。PBS洗滌5 min×4次。滴加1滴HRP-羊抗兔IgG，37 ℃ 30 min。PBS 洗滌5 min×4次。(6)DAB顯色。(7)蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。應(yīng)用Leika DMR病理成像系統(tǒng)，每張切片選取2個(gè)高倍視野照相，每張圖片隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域測(cè)量其陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度，10個(gè)數(shù)據(jù)的均數(shù)作為此切片的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blotting雜交檢測(cè)VSMC BIP蛋白表達(dá) (1)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)：取兔胸主動(dòng)脈上段蛋白35 μg與5×蛋白上樣緩沖液混合均勻后于100 ℃水浴10 min，分別上樣，100～200 V電泳至條帶分離。(2)轉(zhuǎn)膜：準(zhǔn)備NC膜和Whatman濾紙，依次將濾紙(3張)、凝膠、NC膜、濾紙(3張)置于支撐架上，NC膜面對(duì)陽(yáng)極側(cè)。接通電源，4 ℃下300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，蛋白轉(zhuǎn)移1.5 h，β-actin轉(zhuǎn)移1.0 h。轉(zhuǎn)膜完畢后，取出NC膜，用利春紅染液染膜，檢測(cè)轉(zhuǎn)移效果。(3)封閉，抗體免疫及顯色封閉：NC膜放入一平皿中，加入足量的5%脫脂奶粉封閉液(TBST配制)，室溫下封閉2.5～3.0 h。加一抗BIP 1∶1 000；Chop 1∶1 000，37 ℃ 2 h；TBST漂洗3次，10 min/次；加二抗(HRP標(biāo)記)，37 ℃ 2 h；TBST漂洗3次，10 min/次；ECL發(fā)光液混合，待膜干后，平鋪其上；待反應(yīng)5 min后，暗室壓片5 min；顯影1～3 min，水洗，定影1～3 min，照相。應(yīng)用Leica DMR病理圖像分析系統(tǒng)，分別測(cè)量目的蛋白和β-actin條帶的積分光密度，以目的蛋白和β-actin條帶的積分光密度比值判斷BIP蛋白的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察 兔胸主動(dòng)脈組織HE染色顯示，正常組血管內(nèi)膜光滑，內(nèi)彈性膜明顯，內(nèi)皮細(xì)胞呈規(guī)則的單層扁平形，內(nèi)膜層與中膜層分界清晰，中膜層VSMC形態(tài)規(guī)則，排列整齊(見圖1A)。模型組血管內(nèi)膜層顯著增厚，內(nèi)彈性膜消失，內(nèi)膜層與中膜層分界不清晰，中膜層VSMC增生并向內(nèi)膜移行，并見大量膠原纖維形成(見圖1B)。葛低組可見血管內(nèi)膜層相對(duì)完整，內(nèi)膜層與中膜層分界相對(duì)清晰，中膜層VSMC增生明顯(見圖1C)。葛高組可見血管內(nèi)膜層完整、清晰，內(nèi)彈性膜明顯，內(nèi)膜層與中膜層分界相對(duì)清晰，中膜層VSMC形態(tài)規(guī)則，排列整齊(見圖1D)。

2.2 原位雜交檢測(cè)VSMC BIP mRNA表達(dá) BIP mRNA信號(hào)表達(dá)細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性，細(xì)胞核陰性，提示該基因片段定位于細(xì)胞質(zhì)。正常組VSMC細(xì)胞質(zhì)中可見少量棕黃色顆粒表達(dá)，表明探針與VSMC細(xì)胞質(zhì)中的BIP mRNA結(jié)合(見圖2A)。模型組與正常組比較，VSMC細(xì)胞質(zhì)中聚集的棕黃色顆粒增多，表明模型組兔AS病變組織VSMC BIP mRNA表達(dá)信號(hào)比正常組增強(qiáng)(見圖2B)。葛低組與模型組比較，可見VSMC細(xì)胞質(zhì)聚集的棕黃色顆粒減少，表明葛低組VSMC BIP mRNA陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)降低 (見圖2C)。葛高組與模型組比較，可見VSMC細(xì)胞質(zhì)聚集的棕黃色顆粒明顯減少，表明葛高組VSMC BIP mRNA陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)明顯降低(見圖2D)。

各組VSMC BIP mRNA表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組、葛低組、葛高組BIP mRNA表達(dá)量高于正常組，葛低組、葛高組低于模型組，葛高組又低于葛低組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

注：A為正常組，B為模型組，C為葛低組，D為葛高組

圖1 各組兔胸主動(dòng)脈組織病理(HE染色，×100)

Figure1 The histopathology of thoracic aorta in various groups

注：A正常組可見少量BIP mRNA陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)；B模型組BIP mRNA陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)顯著增強(qiáng)；C葛低組BIP mRNA陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)明顯降低；D葛高組BIP mRNA陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)顯著降低

圖2 原位雜交檢測(cè)各組兔胸主動(dòng)脈上段VSMC BIP mRNA表達(dá)信號(hào)

Figure2 The expression signal of BIP mRNA which located in the cytoplasm of VSMC in the superior segment of thoracic aorta which detected by situ hybridization

2.3 Western blotting雜交檢測(cè)VSMC BIP蛋白表達(dá) Western blotting雜交結(jié)果顯示，各組VSMC中均有BIP蛋白表達(dá)(見圖3)，且BIP蛋白表達(dá)量間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組、葛低組、葛高組BIP蛋白表達(dá)量高于正常組，葛低組、葛高組低于模型組，葛高組又低于葛低組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

注：A為正常組，B為模型組，C為葛低組，D為葛高組；BIP=免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白

圖3 Western blotting雜交檢測(cè)各組兔胸主動(dòng)脈上段VSMC BIP蛋白表達(dá)情況

Figure3 The BIP protein expression which located in the cytoplasm of VSMC in the superior segment of thoracic aorta which detected by Western blotting hybridization

Table1 Comparison of BIP mRNA and protein expression levels in VSMC of four groups

組別只數(shù)BIPmRNABIP蛋白正常組85238±426048±002模型組811542±852?108±001?葛低組88615±614?△076±002?△葛高組86728±551?△▲072±002?△▲F值15193158330P值00000000

注：BIP=免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白；與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與葛低組比較，▲P<0.05

3 討論

葛根通脈飲方劑經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床應(yīng)用證明對(duì)AS所致的心腦血管疾病具有一定的治療作用，且可以顯著降低血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白B-100(apoB-100)、Hcy水平，提高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，可改善頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度，穩(wěn)定斑塊，降低斑塊積分，聯(lián)合使用葛根通脈飲改善血脂的療效優(yōu)于常規(guī)治療[9]。葛根通脈飲治療AS取得了滿意的療效，具有較高的臨床價(jià)值和社會(huì)效益。

葛根通脈飲方中葛根通暢血脈、升陽(yáng)解痙為君藥；山楂活血散瘀、化痰行氣，赤芍、川芎行血活血，共助葛根散瘀通脈為臣；當(dāng)歸、淫羊藿、太子參補(bǔ)氣養(yǎng)血，以達(dá)氣帥血行、通而不滯之功，為佐藥；炙甘草為使，調(diào)和諸藥，補(bǔ)中益氣。該方治療AS及相關(guān)心腦血管疾病，具有良好療效。藥理學(xué)研究顯示，葛根具有抗氧化、抗缺血、降血壓、抗AS的作用，其君藥重要成分葛根素能夠抑制脂類過(guò)氧化、清除自由基、抑制醛糖還原酶活性，降低血小板表面活性，抑制血小板凝聚和黏附，能夠保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[10]。研究顯示，在體外建立Hcy誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，使用不同濃度葛根素作用后，能夠拮抗Hcy誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其中GRP78/BIP基因低表達(dá)可能是其抗AS的作用機(jī)制之一[11]。淫羊藿具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨的功效，除去上述功能，現(xiàn)代藥理學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)淫羊藿也具有改善心腦血管疾病的功能，可以通過(guò)降低血脂，抑制細(xì)胞黏附分子1(ICAM-1)mRNA表達(dá)，促進(jìn)VSMC凋亡以及抗血管氧化作用，抗高脂血癥所致早期AS形成[12]。另有報(bào)道顯示，淫羊藿苷通過(guò)抑制核因子κB(NF-κB)的活性明顯地抑制兔主動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，NF-κB作為一種重要的炎癥前基因的早期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，淫羊藿苷可抑制活化NF-κB，抑制生成活性氧基團(tuán)，繼而抑制細(xì)胞黏附因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄，從而干預(yù)AS的形成[13]。

大量的臨床試驗(yàn)和流行病學(xué)研究證實(shí)Hcy是誘發(fā)心血管疾病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子，可以通過(guò)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和促進(jìn)VSMC增殖來(lái)促進(jìn)AS的形成[14]，Hcy能夠部分通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的ERS而引起AS，Hcy引起的ERS級(jí)聯(lián)反應(yīng)表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻、ERS蛋白表達(dá)以及細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生，其中BIP作為反應(yīng)性基因，在Hcy激活的ERS過(guò)程中表達(dá)量上升，并通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)死亡途徑引起細(xì)胞凋亡，其表達(dá)量在一定程度上反映了細(xì)胞ERS自我保護(hù)性反應(yīng)的水平[15-17]。本研究通過(guò)高膽固醇高蛋氨酸飲食建立AS模型，蛋氨酸在酶的作用下可轉(zhuǎn)化為Hcy，進(jìn)而損傷動(dòng)脈管壁內(nèi)皮細(xì)胞，使膽固醇和TG沉積于動(dòng)脈壁上，導(dǎo)致AS的形成。AS模型組兔胸主動(dòng)脈病理組織學(xué)觀察可見VSMC增生，內(nèi)膜面積增加，還見到脂質(zhì)沉積、斑塊形成。葛高組兔胸主動(dòng)脈組織血管內(nèi)膜層完整、清晰，內(nèi)彈性膜明顯，內(nèi)膜層與中膜層分界相對(duì)清晰，中膜層VSMC形態(tài)規(guī)則，排列整齊接近正常組。提示高同型半胱氨酸血癥可引起血管內(nèi)膜增厚、平滑肌細(xì)胞增生等早期動(dòng)脈硬化改變，而葛根通脈飲對(duì)Hcy引起的血管病變可能有修復(fù)作用。

此外，本研究還對(duì)葛根通脈飲拮抗由Hcy誘導(dǎo)的兔AS模型中胸主動(dòng)脈血管損傷的作用機(jī)制進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)葛根通脈飲通過(guò)綜合調(diào)控ERS信號(hào)通路中BIP mRNA及其蛋白的表達(dá)量，來(lái)延緩或逆轉(zhuǎn)AS的出現(xiàn)。原位雜交和Western blotting雜交結(jié)果均顯示葛根通脈飲干預(yù)后BIP mRNA及其蛋白表達(dá)量低于模型組，且高劑量的葛根通脈飲作用更強(qiáng)。提示葛根通脈飲保護(hù)血管的機(jī)制之一是減輕ERS導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，BIP mRNA是其一個(gè)重要的作用靶點(diǎn)；而高劑量葛根通脈飲對(duì)VSMC的保護(hù)作用優(yōu)于低劑量的葛根通脈飲。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察葛根通脈飲對(duì)Hcy損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞ERS反應(yīng)途徑中的重要分子——BIP mRNA及其蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)了葛根通脈飲拮抗血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等抗AS藥理學(xué)效應(yīng)的分子機(jī)制和可能的作用靶點(diǎn)，為中藥葛根的開發(fā)和AS的防治提供了理論線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。而且，隨著葛根通脈飲相關(guān)藥理學(xué)研究的不斷深入以及相關(guān)信號(hào)通路的不斷探索，葛根通脈飲在心腦血管疾病中的作用機(jī)制也在不斷被闡明，為促進(jìn)我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)具有重大的推動(dòng)作用。

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