王 超，邢邯英，王 杏，劉 敏，張 哲

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是臨床2型糖尿病患者常見的微血管病變并發(fā)癥之一，是一種具有特異性改變的眼底病變，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。DR發(fā)生的確切機(jī)制仍未明確，有研究表明持續(xù)性高血糖、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、血-視網(wǎng)膜屏障受損等因素均會引起DR的病理生理變化；大量文獻(xiàn)報道了炎癥在DR生成中占有重要地位，隨后的研究也確定了DR是一種“炎癥疾病”[2]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)等多種炎性因子含量在 DR患者玻璃體、房水、血清中增加，它們之間的相互作用影響了DR疾病的發(fā)生發(fā)展。本實驗采用自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠作為DR小鼠模型，觀察通心絡(luò)膠囊對KK/Upj-Ay小鼠血清及視網(wǎng)膜炎性因子表達(dá)的影響，為臨床治療糖尿病微血管病變提供新的用藥選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠40只，12周齡，雄性，30～40 g；C57BL/6小鼠10只，12周齡，雄性，25～30 g。均購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK-(京)2009-0002。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 通心絡(luò)膠囊購于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司。TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β一抗購于Abcam公司。7300 Real-Time PCR System儀購于ABI公司；Biorad凝膠成像分析儀購于Biorad公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組 按KK/Upj-Ay小鼠空腹血糖(FBG)水平從低到高排列，然后按照隨機(jī)數(shù)字表法，將小鼠分為模型組、通心絡(luò)低劑組、通心絡(luò)中劑組、通心絡(luò)高劑組，保證各組小鼠平均FBG水平間無差異；另設(shè)C57BL/6小鼠為對照組，每組10只小鼠。各組小鼠灌胃給藥，通心絡(luò)低劑組、通心絡(luò)中劑組、通心絡(luò)高劑組小鼠分別給予1、2、4 g生藥/kg的通心絡(luò)膠囊，對照組和模型組小鼠灌胃等體積的蒸餾水，1次/d。各組小鼠自由飲食飲水，連續(xù)12周。

1.2.2 體質(zhì)量及FBG測定 每月記錄1次小鼠體質(zhì)量。實驗結(jié)束后從小鼠眼球取血，測定FBG水平。

1.2.3 血-視網(wǎng)膜屏障功能測定 給藥結(jié)束，每組取6只小鼠，尾靜脈注射50 mg/kg伊文思藍(lán)(EB)溶液。2 h后麻醉小鼠，灌注4%多聚甲醛緩沖液，灌注壓力為80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。灌注4 min后摘除眼球，分離視網(wǎng)膜，稱量。將視網(wǎng)膜放入150 μl甲酰胺溶液，37 ℃孵育12 h，3 000 r/min 離心(離心半徑13.5 cm)10 min，取上清液置96孔酶標(biāo)板，620 nm處測定光密度(OD)。通過比色法測定EB的含量(單位為ng/mg)，從而反映血-視網(wǎng)膜屏障功能。

1.2.4 視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察 實驗結(jié)束，快速取小鼠眼球，用甲醛固定，脫水切片，HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測小鼠全血中炎性因子水平 每組取3只小鼠全血，分離外周血單個核細(xì)胞，加入(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(PMA)和離子霉素刺激淋巴細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞，Exp32軟件獲取分析細(xì)胞。每個檢測獲取10 000個細(xì)胞，分析TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β的表達(dá)。

1.2.6 Real time PCR測定小鼠視網(wǎng)膜炎性因子mRNA的表達(dá) 取小鼠視網(wǎng)膜，常規(guī)方法提取組織RNA，鑒定，按試劑盒說明書進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參照。TNF-α引物：上游5′- CCACCACGCTCTTCTGTCTA -3′，下游5′-GGCAGCCTTGTCCCTTGAA-3′，產(chǎn)物片段315 bp；IL-6引物：上游5′-GTTGCCTTCTTGGGACTGATG-3′，下游5′- CCTTAGCCACTCCTTCTGTGAC -3′，產(chǎn)物片段525 bp；ICAM-1引物：上游5′- TTCCGCTACCATCACCGTGT -3′，下游5′-AGGTCCTTGCCTACTTGCTG -3′，產(chǎn)物片段84 bp；IL-1β引物：上游5′-AGCCCATCCTCTGTGACTCA-3′，下游5′- TTTGTTGTTCATCTCGGAGCC-3′，產(chǎn)物片段99 bp；GAPDH引物：上游5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′，下游5′-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3′，產(chǎn)物片段143 bp。用儀器自帶軟件分析，將對照組設(shè)置為1，與對照組進(jìn)行比較后的相對定量值為目的基因表達(dá)。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測小鼠視網(wǎng)膜炎性因子蛋白的表達(dá) 每組取3只小鼠的視網(wǎng)膜，加裂解液提取視網(wǎng)膜組織蛋白，加入稀釋合適濃度的TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β抗體，化學(xué)發(fā)光法顯色。以β-actin作為內(nèi)參，掃描后對條帶進(jìn)行吸光度積分分析，以目的蛋白吸光度值/β-actin吸光度值的比值為目的蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量及FBG的變化 給藥前，模型組及通心絡(luò)各劑量組小鼠體質(zhì)量及FBG水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；給藥后12周，模型組及通心絡(luò)各劑量組小鼠體質(zhì)量及FBG水平仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；雖然給藥后12周，通心絡(luò)各劑量組小鼠體質(zhì)量及FBG水平較模型組有下降的趨勢，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.2 各組小鼠給藥后12周視網(wǎng)膜EB含量比較 給藥后12周，各組小鼠視網(wǎng)膜EB含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；其中模型組及通心絡(luò)低劑組小鼠視網(wǎng)膜EB含量高于對照組，通心絡(luò)中、高劑組小鼠視網(wǎng)膜EB含量低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

Table1 Comparison of the body weights and FBG levels among various groups of mice before treatment and 12 weeks after treatment

組別只數(shù)體質(zhì)量(g) 給藥前 給藥后12周FBG(mmol/L) 給藥前 給藥后12周對照組10252±10305±2853±0855±09模型組10344±20?460±22?148±27?175±28?通心絡(luò)低劑組10350±20?444±34?147±28?165±24?通心絡(luò)中劑組10348±30?443±20?146±26?158±19?通心絡(luò)高劑組10349±19?434±38?149±23?150±23?F值4346489132455160P值000000000000

注：FBG=空腹血糖；與對照組比較，*P<0.01

Table2 Comparison of EB content in retina among various of groups of mice 12 weeks after treatment

組別只數(shù)EB對照組6126±26模型組6255±36△通心絡(luò)低劑組6208±39?通心絡(luò)中劑組6164±26▲通心絡(luò)高劑組6161±24▲F值1567P值000

注：EB=伊文思藍(lán)；與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01

2.3 各組小鼠給藥后12周視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化 給藥后12周，光鏡下觀察到對照組小鼠視網(wǎng)膜色素上皮層，視錐、視桿細(xì)胞層，外界膜，外顆粒層等各層細(xì)胞層次分明，排列整齊，結(jié)構(gòu)緊密；模型組小鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列紊亂，色素上皮層細(xì)胞明顯變?。欢ㄐ慕j(luò)各劑量組小鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列較清晰(見圖1)。

2.4 各組小鼠給藥后12周血液中炎性因子水平比較 給藥后12周，各組小鼠血液中TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；其中模型組及通心絡(luò)各劑量組小鼠TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平高于對照組，通心絡(luò)中、高劑組小鼠TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平低于模型組，通心絡(luò)各劑量組小鼠IL-6水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

Table3 Comparison of blood levels of TNF-α，ICAM-1，IL-6 and IL-1β among various groups of mice 12 weeks after treatment

組別只數(shù)TNF-αICAM-1IL-6IL-1β對照組3363±067033±006210±040137±029模型組31893±355△750±110△643±060△1050±235△通心絡(luò)低劑組31443±190△697±071△403±086?☆883±171△通心絡(luò)中劑組3960±130△☆420±080△☆390±061?☆513±081△☆通心絡(luò)高劑組3720±176?★320±066△★380±040?★393±070△☆F值2534460319972118P值000000000000

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，ICAM-1=細(xì)胞間黏附分子1，IL-6=白介素6，IL-1β=白介素1β；與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，☆P<0.05，★P<0.01

2.5 各組小鼠給藥12周后視網(wǎng)膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 給藥后12周，各組小鼠視網(wǎng)膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；其中模型組小鼠視網(wǎng)膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表達(dá)水平高于對照組，通心絡(luò)各劑量組小鼠視網(wǎng)膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表4、圖2、圖3)。

3 討論

通心絡(luò)膠囊是以人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻等組方的中藥復(fù)方制劑，具有益氣活血、通絡(luò)止痛功能。文獻(xiàn)報道通心絡(luò)具有改善血液流變學(xué)、血管內(nèi)皮功能、微循環(huán)的功能，對臨床DR患者有治療作用[3]，但其具體機(jī)制尚不明確。DR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括持續(xù)性高血糖、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[4]。本研究采用了自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠作為DR小鼠模型[5]，觀察到通心絡(luò)膠囊灌胃12周能明顯改善KK/Upj-Ay小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞層次較清楚，小鼠血-視網(wǎng)膜屏障功能得到明顯改善，表明通心絡(luò)膠囊對治療DR有一定的作用。但本研究觀察到通心絡(luò)膠囊并未明顯降低小鼠體質(zhì)量和FBG，故推測降糖不是通心絡(luò)膠囊治療DR的主要機(jī)制。

炎性反應(yīng)在DR發(fā)生發(fā)展中占有重要地位[6]。朱丹等[3]認(rèn)為DR是一種“炎性疾病”。主要的炎性因子有TNF-α、ICAM-1、IL-1、單核細(xì)胞黏附因子1(MCP-1)等[7]。DR中的炎性因子包括全身因子和局部因子。臨床研究顯示DR患者血清中全身炎性因子IL-1β、TNF-α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)濃聚，與 DR的發(fā)生和嚴(yán)重性密切相關(guān)[8]。本研究中，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示DR小鼠血清TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平較對照組小鼠升高，表明全身炎性因子可能共同作用于DR的發(fā)展。給予通心絡(luò)膠囊灌胃治療12周，小鼠血清TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平較模型組小鼠降低，提示通心絡(luò)膠囊有抑制DR小鼠全身炎性因子的作用。

注：1為對照組，2為模型組，3為通心絡(luò)低劑組，4為通心絡(luò)中劑組，5為通心絡(luò)高劑組

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×200)

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，★P<0.01

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，ICAM-1=細(xì)胞間黏附分子1，IL-6=白介素6，IL-1β=白介素1β

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜炎性因子mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

Figure2 Amplification curve of real-time fluorescent quantitative PCR for retina inflammatory cytokines mRNA expression level of various groups of mice

注：1為對照組，2為模型組，3為通心絡(luò)低劑組，4為通心絡(luò)中劑組，5為通心絡(luò)高劑組

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜炎性因子表達(dá)水平的Western blotting結(jié)果

Figure3 Results of Western blotting of retina inflammatory cytokines expression level of various groups of mice

Suzuki等[9]研究發(fā)現(xiàn)DR玻璃體中炎性因子IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、MCP-1、血小板衍生因子(PDGF)、VEGF水平增高。玻璃體內(nèi)IL-6、VEGF、ICAM-1與糖尿病黃斑水腫的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。在DR小鼠視網(wǎng)膜中，本研究也觀察到了炎性因子TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRAN及蛋白表達(dá)水平升高，提示炎癥在DR小鼠中的重要作用；同時觀察到通心絡(luò)膠囊能降低視網(wǎng)膜中TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表達(dá)水平，提示通心絡(luò)膠囊不僅能降低全身炎性因子水平，還能抑制視網(wǎng)膜局部炎性因子的表達(dá)，最終達(dá)到抑制炎癥治療DR的作用。通心絡(luò)膠囊十二味中藥組方中，人參、水蛭和赤芍現(xiàn)代藥理研究表明均具有顯著的抗炎作用，因此本研究推測通心絡(luò)膠囊抑制DR小鼠炎性因子表達(dá)與此有關(guān)，但其具體抗炎成分尚需進(jìn)一步研究。另外，在本研究中，1～4 g生藥/kg通心絡(luò)膠囊量效關(guān)系有一定的趨勢，但無差異。在通常研究中，化藥有很明確的量效關(guān)系，但中藥不同，很難有特別明確的劑量關(guān)系，也許是中藥本身的特性。

目前，炎性遞質(zhì)已經(jīng)成為了治療視網(wǎng)膜損傷的治療靶點，如VEGF阻滯劑[10]、血管緊張素2(Ang-2)抑制劑、TNF-α抑制劑等。通心絡(luò)膠囊在臨床應(yīng)用多年，具有不良反應(yīng)小的中藥傳統(tǒng)優(yōu)勢，對其進(jìn)行深入研究將為臨床治療DR提供新的用藥思路。

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10 Montero JA，Ruiz-Moreno JM，Correa ME.Intravitreal anti-VEGF drugs as adjuvant therapy in diabetic retinopathy surgery[J].Curr Diabetes Rev，2011，7(3)：176-184.

本文鏈接——

1 KK/Upj-Ay小鼠是一種毛色基因(Ay)突變的2型糖尿病動物模型，Ay基因不僅影響小鼠的毛色，還可引起代謝紊亂，也可出現(xiàn)高飲食、肥胖、高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂和高胰島素血癥，因此要比同周齡的C57BL/6正常小鼠體質(zhì)量大很多。

2 自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠用于糖尿病視網(wǎng)膜病變研究已有多篇文獻(xiàn)報道，如本文參考文獻(xiàn)[5]。另外，光鏡下也觀察到了KK/Upj-Ay小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化(見圖1)，故本研究以KK/Upj-Ay小鼠作為糖尿病視網(wǎng)膜病變模型。

3 本研究根據(jù)小鼠空腹血糖(FBG)分組，就是將所有的小鼠測定FBG，然后按照FBG水平從低到高排列，水平相近的4只小鼠配成1個區(qū)組。再根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，每個小鼠對應(yīng)一個隨機(jī)數(shù)字，在每個區(qū)組內(nèi)將隨機(jī)數(shù)字按大小排序，序號為1的為模型組，序號為2的為通心絡(luò)低劑組，序號為3的為通心絡(luò)中劑組，序號為4的為通心絡(luò)高劑組，這樣保證模型組及通心絡(luò)低、中、高劑組小鼠平均FBG水平間有均衡性。