戚 迪，何 婧，葉 媛，馮龍華，王導(dǎo)新

非心源性肺水腫造成的氧合功能障礙是導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)頑固性低氧血癥的特異性原因，因此，如何維持有效肺泡水腫液清除(alveolar fluid clearance,AFC)是改善氣體交換、提高血氧飽和度、降低病死率的關(guān)鍵[1-2]。肺泡上皮鈉通道(epithelial sodium channel,ENaC)是由α、β、γ亞基組成三聚體,作為肺泡上皮鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)的限速環(huán)節(jié)，在ARDS所致肺水腫的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色,其調(diào)控機(jī)制及通路的研究具有重要價(jià)值[3-4]。多項(xiàng)研究表明，17β-雌二醇作為一種重要的類固醇激素可通過多方面作用改善ARDS[5-10]。β-雌二醇對于ENaC的經(jīng)典調(diào)節(jié)機(jī)制是通過17β-雌二醇受體反應(yīng)元件(estrogen relative element,ERE)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，但近年來，其通過快速激活細(xì)胞內(nèi)信號通路介導(dǎo)的非基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制引起關(guān)注[11-12]。眾所周知ENaC的活化及表達(dá)受AGC激酶家族(protein kinase A/protein kinase G/protein kinase C)的調(diào)節(jié)，其中SGK1(serum-glucocorticoid-induced kinase 1)作為一種重要的AGC激酶，在調(diào)控離子液體轉(zhuǎn)運(yùn)中扮演重要角色[13-15]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)及其直接靶蛋白——蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT) 是機(jī)體應(yīng)對損傷的一條重要的內(nèi)源性負(fù)反饋通路，且與ARDS發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[16-19]。但17β-雌二醇通過該通路對ENaC的調(diào)節(jié)作用研究甚少。本研究旨在通過建立ARDS小鼠模型，觀察17β-雌二醇介導(dǎo)的PI3K/AKT/SGK1信號通路對ARDS ENaC的調(diào)控作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級雄性C57B/L6小鼠40只，5～8周齡，體質(zhì)量(20±5) g〔重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號:SCXK(渝) 2012-0001〕，普通光照環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水與攝食喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 脂多糖(LPS,E.coli,O111:B4)、渥曼青霉素及17β-雌二醇購于Sigma公司；髓過氧化物酶(MPO) 檢測試劑盒購于南京建成工程生物研究所；總RNA 提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒、DNA marker DL1000 購于寶生物工程(大連)有限公司；RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)及BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購于北京四正柏生物科技有限公司；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、α-、β-、γ-ENaC單克隆抗體購于Abcam 公司；磷酸化AKT(p-AKT，Ser473)抗體購于Cell Signaling 公司；磷酸化SGK1(p-SGK1，Ser422)多克隆抗體購于Epitomics公司；ECL檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠ARDS模型建立 40只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(control組)、模型組(LPS組)、17β-雌二醇治療組(E2組)、渥曼青霉素干預(yù)組(wortmannin組)，每組10只。腹腔注射4%水合氯醛(0.2 ml/20 g)麻醉小鼠。LPS組、E2組、wortmannin組通過氣管插管注射5 mg/kg無菌LPS(10 μg LPS溶于50 μl無菌0.9%氯化鈉溶液)，誘導(dǎo)建立ARDS模型,并根據(jù)血?dú)夥治雠袛嘟３晒Αontrol組給予無菌0.9%氯化鈉溶液代替LPS。E2組及wortmannin組于LPS注射后20 min分別腹腔注射17β-雌二醇(1 mg/kg)。wortmannin組分別于 LPS 注射前90 min，注射后 90 min、360 min給予PI3K抑制劑渥曼青霉素(0.06 mg/kg)，E2組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液。

1.3.2 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察小鼠肺組織病理變化并進(jìn)行肺損傷評分 8 h處死小鼠，取右下肺組織，4%多聚甲醛固定，制成5 μm的石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。肺損傷評分標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺泡充血，(2)出血，(3)肺泡或血管腔內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤或聚集，(4)肺泡壁增厚和/或透明膜形成。依據(jù)病變輕重評0～4分(0分：無病變或非常輕微；1分：輕度病變；2分：中度病變；3分：重度病變；4分：極重度病變)。ARDS總評分為各項(xiàng)評定分?jǐn)?shù)相加總和。

1.3.3 小鼠血?dú)夥治?根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，于LPS注射前30 min，注射后30 min 、1 h、4 h、8 h 經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈采集1 ml動(dòng)脈血，并用肝素抗凝(1∶1 000)，立即送檢，全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x檢測動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)。

1.3.4 小鼠肺水腫檢測 造模8 h后處死小鼠取出肺組織，放置于事先稱重的錫箔紙上稱量肺濕重，再將樣本置于80 ℃烤箱48 h至恒重后，稱量其干重。根據(jù)公式計(jì)算肺濕干比(W/D=濕重/干重),反映肺水腫的嚴(yán)重程度。

1.3.5 小鼠肺泡灌洗液(BALF)檢測 造模8 h后,以1 ml PBS分3次肺泡灌洗。收集前兩次BALF，并于4 ℃ 14 000 r/min離心30 min(離心半徑15 cm)，取上清液，按照BCA蛋白測定試劑盒說明測定BALF總蛋白含量。按照ELISA試劑盒要求，BALF 4 ℃以400 r/min離心5 min(離心半徑15 cm)，沉渣以100 μl PBS液重懸，測定BALF中白介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。按照MPO試劑盒要求，檢測BALF中MPO活性水平。

1.3.6 RT-PCR法檢測小鼠肺組織α-、β-、γ-ENaC mRNA表達(dá)水平 采用RT-PCR 法，按照總RNA提取試劑盒說明書提取各組小鼠肺組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測總RNA濃度。依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以小鼠肺組織總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。冰上配制RT反應(yīng)液如下：0.5 μg總RNA為模板，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μl,Oligo(dT)18引物(50 μmol/L)0.5 μl,隨機(jī)6核苷酸引物(100 mmol/L)0.5 μl,以DEPC水補(bǔ)充至10 μl。反應(yīng)條件如下:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。按照擴(kuò)增試劑盒說明書，建立PCR 反應(yīng)體系如下：2 μl cDNA模板、Premix Taq 25 μl、正反引物各1 μl，以DEPC水補(bǔ)充至50 μl。引物序列如下：α-ENaC：上游引物5′-TACAACTCTTCCTACACTCGCCA-3′,下游引物5′-CTGGTTGAAACGACAGGTAAAGAT-3′；β-ENaC上游引物5′-CAATGACACCCAGTATAAGATGACC-3′,下游引物5′-CAATGAGGCACAGCACCGA-3′；γ-ENaC：上游引物5′-CAATGAGAACGAGAAGGGAAAG-3′,下游引物5′-AAGAAGCAGGTCACCAGCAGT-3′；內(nèi)參β-actin:上游引物5′-CGAGCGGGCTACAGCTTC-3′，下游引物5′-GTCACGCACGATTCCCTCT-3′。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性 94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火溫度分別為：α-、β-ENaC 56 ℃；γ-ENaC、β-actin 57 ℃，退火時(shí)間分別為：α-ENaC 25 s；β-ENaC 17 s；γ-ENaC 18 s；β-actin 37 s。延伸72 ℃ 60 s,循環(huán)35輪，再延伸72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物10 μl與上樣緩沖液混勻，2.5%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像，Quantity One軟件進(jìn)行分析，并以目的條帶與β-actin 條帶灰度的比值衡量α-、β-、γ-ENaC mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.7 Western blotting法檢測小鼠肺組織α-、β-、γ- ENaC，p-AKT，p-SGK1蛋白的表達(dá) 按照試劑盒操作要求，RIPA裂解液提取肺組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，-80 ℃ 保存。蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜(PVDF膜)上，5%脫脂奶粉或5%BSA封閉1 h，分別加入抗體α-ENaC(1∶300) 、β-ENaC(1∶1 000)、γ-ENaC(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000) 、p-SGK1(1∶500)、β-actin(1∶8 000)4 ℃ 孵育過夜。PBST洗膜3遍，10 min/次。加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶8 000),室溫孵育1.5 h，PBST洗膜3遍，10 min/次。ECL顯色。凝膠成像，并以Quantity One 軟件分析目的條帶與β-actin條帶灰度的比值衡量α-、β-、γ-ENaC、p-AKT、p-SGK1蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察小鼠肺組織病理變化并進(jìn)行肺損傷評分 肺組織切片常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。control組：肺組織未見肺泡腔內(nèi)水腫出血或透明膜，肺泡間隔均一無增寬，未見炎性細(xì)胞浸潤(見圖1A)。LPS組：肺組織損傷明顯，肺泡上皮腫脹嚴(yán)重，肺泡腔內(nèi)及間質(zhì)水腫出血嚴(yán)重。肺泡間隔增厚明顯并伴大量炎性細(xì)胞浸潤(見圖1B)。E2組：肺組織損傷明顯減輕，肺泡腔內(nèi)水腫出血減輕，間隔輕度增寬，炎性細(xì)胞浸潤減輕(見圖1C)。wortmannin組：肺組織損傷較明顯，肺泡及間質(zhì)水腫出血較明顯，肺泡間隔增厚伴炎性細(xì)胞浸潤增加(見圖1D)。LPS組肺損傷評分為(4.2±0.2)分，E2組為(2.7±0.5)分，wortmannin組為(3.9±0.3)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.07，P=0.000)；其中E2組較LPS組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=12.70，P=0.000)，wortmannin組較E2組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=9.52，P=0.004)。

2.2 小鼠PaO2變化 4組不同時(shí)間PaO2比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F總=188.148，P總=0.000)；其中LPS組、E2組、wortmannin組PaO2各個(gè)時(shí)間點(diǎn)較control組均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；E2組與LPS組比較，30 min、1 h時(shí)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=22.393,P=0.000；q=26.690,P=0.000)，4 h、8 h時(shí)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=1.857，P=0.190；q=1.670，P=0.213)。wortamnin組與E2組比較，30 min、1 h時(shí)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=14.399，P=0.001；q=23.250，P=0.000)，4 h、8 h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.415，P=0.527；q=0.379，P=0.546,見圖2)。

2.3 小鼠肺組織W/D比較 4組小鼠肺組織W/D比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中LPS組、E2組、wortmannin組較control組升高，LPS組、wortmannin組較E2組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.4 小鼠BALF中總蛋白含量、IL-1β和TNF-α水平及MPO活性比較 4組小鼠BALF中總蛋白含量、IL-1β和TNF-α水平及MPO活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中LPS組、E2組、wortmannin組以上指標(biāo)較control組升高，LPS組、wortmannin組以上指標(biāo)較E2組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.5 各組小鼠肺組織α-、β-、γ-ENaC 的mRNA表達(dá)水平 RT-PCR法顯示，4組小鼠肺組織α-、β-、γ-ENaC 的mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為4.713、24.652、5.345，P值分別為0.007、0.000、0.004)；其中LPS組、E2組、wortmannin組以上指標(biāo)較control組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LPS組、E2組、wortmannin組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖3)。

2.6 各組小鼠肺組織α-、β-、γ-ENaC表達(dá) Western blotting法顯示，4組小鼠肺組織α-、β-、γ-ENaC表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為14.613、5.672、8.447，P值分別為0.000、0.003、0.000)；其中LPS組和wortmannin組以上指標(biāo)較control組和E2組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

2.7 各組小鼠肺組織p-AKT、p-SGK1表達(dá)水平 Western blotting法顯示，4組小鼠肺組織p-AKT、p-SGK1表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為8.371、8.862，P值分別為0.000、0.000)；其中LPS組和wortmannin組以上指標(biāo)較Control組和E2組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

注：PaO2=動(dòng)脈血氧分壓；與control組比較,#P<0.05；與E2組比較,*P<0.05；與wortmannin組比較，★P<0.05

圖2 各組小鼠不同時(shí)間動(dòng)脈PaO2變化

Figure2 Changes of PaO2in mice of each group

注：A control組，B LPS組，C E2組，D wortmannin組

圖1 小鼠肺組織病理改變(HE染色,×200)

注：W/D=肺濕干比，IL-1β=白介素1β，TNF-α=腫瘤壞死因子α，MPO=髓過氧化物酶；與control組比較,*P<0.05；與E2組比較，△P<0.05

注：ENaC=肺泡上皮鈉通道；與control組比較,*P<0.05

圖3 各組小鼠肺組織α-、β-、γ-ENaC 的mRNA表達(dá)水平比較

Figure3 Comparison of α-,β-,γ-ENaC mRNA transcription in lung tissues of mice

注：與control組比較,#P<0.05；與E2組比較,*P<0.05

圖4 各組小鼠肺組織α-、β-、γ-ENaC表達(dá)比較

Figure4 Comparison of α-,β-,γ-ENaC protein expression in lung tissue of mice

注：與control組比較,#P<0.05；與E2組比較,*P<0.05

圖5 小鼠肺組織p-AKT、p-SGK1的蛋白表達(dá)

Figure5 p-AKT and p-SGK1 protein expression in lung tissue of mice

3 討論

ARDS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病死率高，主要的病理生理改變?yōu)閺浡苑螕p傷，肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與肺泡上皮細(xì)胞屏障的通透性增高，富含蛋白的炎性水腫液集聚于肺泡及肺間質(zhì)，造成肺通氣/血流比值失調(diào)，順應(yīng)性下降，臨床表現(xiàn)為明顯的呼吸窘迫、嚴(yán)重的頑固性低氧血癥。非心源性肺水腫造成的氧合功能障礙是導(dǎo)致ARDS頑固性低氧血癥的特異性原因[1]。因此，增強(qiáng)AFC對恢復(fù)患者肺換氣能力、改善氧合具有積極意義[2]。ENaC作為鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的限速通道蛋白，協(xié)同肺泡基底膜的鈉/鉀ATP酶，在維持肺泡鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)平衡和促進(jìn)AFC過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[3]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)α-、β-、γ- 3個(gè)亞基共同參與ENaC的組成及鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)功能，敲除或抑制某個(gè)亞基的表達(dá)都會(huì)導(dǎo)致Na+電流減小，造成肺泡鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，AFC顯著下降，肺水腫加劇[4]。

目前，臨床應(yīng)用最有效的抗炎、消散肺水腫液藥物糖皮質(zhì)激素仍存在多種不良反應(yīng)，17β-雌二醇作為機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的除糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素之外的另一種重要的類固醇激素，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可通過減輕炎性反應(yīng)、抑制一氧化碳合酶、加速炎性細(xì)胞凋亡、上調(diào)水通道蛋白表達(dá)等多方面作用參與調(diào)節(jié)肺臟的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)育，與ARDS關(guān)系密切[5-8]。且臨床研究發(fā)現(xiàn)相對于男性而言，女性對于嚴(yán)重創(chuàng)傷、膿毒血癥、休克、溺水等因素誘發(fā)的ARDS具有更強(qiáng)的抵抗能力[9-10]。17β-雌二醇經(jīng)典的作用途徑是由17β-雌二醇受體(ER)與配體結(jié)合誘導(dǎo)ER與熱休克蛋白(HSP)解離并形成E-ER復(fù)合物,直接或間接與17β-雌二醇反應(yīng)原件(ERE)結(jié)合,從而正向或負(fù)向調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄,但近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)非基因性信號通路快速激活在17β-雌二醇保護(hù)作用中同樣扮演著重要角色[11-12]。ENaC的表達(dá)及活化受多種AGC激酶的調(diào)節(jié)，如c-AMP/PKA、c-GMP/PKG、PKG通路。血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的SGK1作一種重要的AGC激酶，在離子液體轉(zhuǎn)運(yùn)中扮演重要角色，其核心功能為通過抑制泛素連接酶nedd4-2介導(dǎo)的ENaC泛素化，增加ENaC在細(xì)胞膜上的表達(dá)量[13-15]。PI3K/AKT作為多種細(xì)胞信號通路和信號分子磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)功能性交匯通路，在多種應(yīng)激條件下可對機(jī)體發(fā)揮代償性保護(hù)作用。本課題前期實(shí)驗(yàn)及國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道均證實(shí)該通路同樣為介導(dǎo)鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素、胰島素等對ENaC發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用的共用途徑[16-19]。

因此推測17β-雌二醇可能通過快速激活PI3K/AKT/SGK1信號通路介導(dǎo)的非基因調(diào)控機(jī)制對ENaC發(fā)揮上調(diào)作用，從而增強(qiáng)AFC,減輕肺水腫，改善ARDS預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)氣管插管注射LPS造模后小鼠表現(xiàn)出明顯的ARDS病理生理改變，17β-雌二醇干預(yù)后可產(chǎn)生快速抑制ARDS病理生理改變的短效作用，具體表現(xiàn)為：快速減輕肺水腫及炎性反應(yīng)，降低W/D，降低BLAF中總蛋白含量及IL-1β、TNF-α、MPO活性水平，改善缺氧，提示17β-雌二醇對ARDS具有保護(hù)作用。本研究通過對ENaC蛋白、mRNA水平的測定證實(shí)：17β-雌二醇干預(yù)8 h后小鼠的ENaC亞基蛋白表達(dá)均有不同程度的增加，然而ENaC 亞基mRNA水平未明顯改變，提示17β-雌二醇可能通過非基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制快速上調(diào)ENaC的蛋白表達(dá)，促進(jìn)肺水腫液體吸收。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)LPS組中p-AKT及p-SGK1水平降低，而E2組的p-AKT及p-SGK1水平增高，且17β-雌二醇對ENaC的正向調(diào)節(jié)作用可被PI3K的抑制劑渥曼青霉素阻止，進(jìn)一步表明此上調(diào)作用至少部分是通過快速激活細(xì)胞相關(guān)信號通路PI3K/AKT/SGK1信號通路介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，但其具體分子調(diào)控機(jī)制及其與經(jīng)典基因調(diào)控的協(xié)作關(guān)系還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，17β-雌二醇可通過PI3K/AKT/SGK1信號通路介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)對ENaC 發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，為推動(dòng)ARDS病程中肺泡水腫清除，提高肺氧合能力提供基礎(chǔ)理論根據(jù)。

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