廖運學，王昌明，蔣 明，馬禮兵，徐 青，陳 峰，呂 倩

血管性疾病逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點，血管平滑肌細胞(VSMCs) 的增殖和遷移是血管性疾病的重要病理改變[1]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)的全身、局部炎癥及缺氧等因素均可導(dǎo)致肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)的增殖、凋亡及合成分泌功能改變，是COPD繼發(fā)肺動脈高壓的主要機制[2]。研究表明，肺動脈高壓發(fā)生的主要部位在遠端肺動脈[3]。目前原代培養(yǎng)大鼠 PASMCs的方法報道較多，國內(nèi)也有相關(guān)大鼠 PASMCs原代培養(yǎng)及生物學特性與功能研究的報道[4-5]，但關(guān)于原代培養(yǎng)COPD模型大鼠遠端 PASMCs及其功能的研究報道較少。本研究通過建立COPD大鼠模型，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠原代遠端 PASMCs，探討COPD大鼠與正常大鼠遠端PASMCs生物學特性及功能的異同，為COPD繼發(fā)肺動脈高壓發(fā)病機制及藥物防治研究提供更具有代表性的實驗研究對象及研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠12只，8周齡,體質(zhì)量(300±20)g，購自桂林醫(yī)學院動物實驗中心。

1.2 實驗試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO 公司 10×1 L)、胎牛血清(美國GIBCO)、0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液均為Hyclone公司細胞培養(yǎng)產(chǎn)品、青霉素-鏈霉素溶液(100×青-鏈霉素，含10 mU/L青霉素+10 g/L鏈霉素) 和 D′-Hanks 緩沖液(GIBCO)，二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma公司，翻蓋紅色金牌黃果樹香煙(貴陽卷煙廠，焦油量15 mg，煙氣煙堿量1.2 mg)，戊巴比妥鈉注射液、75%乙醇用雙蒸水(ddH2O)配制、經(jīng)表面改性處理的25 cm2一次性細胞培養(yǎng)瓶；小鼠抗大鼠α- 平滑肌肌動蛋白抗體(美國abcam)、山羊抗小鼠 IgG(美國Earthox)，即用型鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒及磷酸鹽緩沖液(PBS)均購于武漢博士德生物工程有限公司。CFDA SE細胞增殖與示蹤檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)、CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.3 實驗儀器 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(德國，Hereus)，倒置相差顯微鏡(日本，OLYMPUS)，熒光顯微鏡(日本，Olympus)，流式細胞儀(BD FACSAria Ш)。

1.4 動物模型的建立 大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，按隨機數(shù)字表法分為2組：(1) COPD模型組：于實驗第1、14天經(jīng)氣道內(nèi)注入脂多糖(LPS)溶液，200 μg/次，予自制有機玻璃艙內(nèi)香煙煙霧暴露，艙內(nèi)小孔與外界空氣相通，保持艙內(nèi)氣壓與外界相等，艙內(nèi)放置無水氯化鈣吸收水分、鈉石灰吸收CO2，1 h/d，共 8 周。(2)對照組：第1、14天經(jīng)氣道內(nèi)注入同等劑量0.9%氯化鈉溶液，無香煙煙霧暴露，與COPD模型組同等條件下正常飼養(yǎng)。

1.5 組織塊貼壁法分離、原代培養(yǎng)大鼠遠端PASMCs 斷頸法處死大鼠后浸泡于75%乙醇中 6 min，在超凈工作臺上開胸取出心肺組織，轉(zhuǎn)移到含有100 U/ml青-鏈霉素的無菌 PBS的培養(yǎng)皿中，漂洗3次，迅速分離出肺動脈三級以下分支，剝凈血管纖維層和外膜，更換培養(yǎng)皿，眼科剪縱行剖開肺動脈，內(nèi)膜面向上，除掉內(nèi)皮細胞層；在新的培養(yǎng)皿中加 4 ml含 25%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，將中膜組織剪成約2 mm3小塊，再接種到一次性25 ml培養(yǎng)瓶，瓶內(nèi)加入 4 ml事先配置好的含25%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml的DMEM培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，組織塊貼在培養(yǎng)瓶底上，每塊間距0.8～1.0 cm為宜。靜置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱5～6 h，使小組織塊貼緊瓶底；翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)液覆蓋于瓶底上的組織小塊，置培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，3 d 換1次培養(yǎng)液，4 d左右可見細胞從組織周圍長出，呈長梭形或“魚尾”狀。

1.6 倒置相差顯微鏡下觀察PASMCs形態(tài)及生長特點 細胞從組織塊周圍長出后，利用每次換液的時機在倒置相差顯微鏡下仔細觀察PASMCs形態(tài)及生長特點并拍下。

1.7 細胞免疫組化染色 細胞爬片多聚甲醛固定后，石蠟切片脫蠟至水，3%過氧化氫室溫5～10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次，抗原修復(fù)，滴加5%胎牛血清清蛋白(BSA)封閉液37 ℃ 30 min，滴加稀釋的小鼠抗大鼠 α-SM-actin單克隆抗體(美國abcam，工作濃度1∶300)，孵育一抗，4 ℃過夜，PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min，共3次；孵育生物素化二抗山羊抗小鼠IgG(美國Earthox)，37 ℃ 30 min，PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×3次；SABC法染色(即用型SABC免疫組化染色試劑盒)，37 ℃ DAB/過氧化氫(H2O2)顯色。Mayor′s蘇木素核固紅復(fù)染，脫水透明，最后封片。顯微鏡下觀察細胞并采圖，胞質(zhì)內(nèi)肌動蛋白染成棕黃、肌絲與細胞長軸平行排列判定為陽性。

1.8 透射電鏡鑒定 采用生長良好的第3代PASMCs，經(jīng)消化離心吸棄上清液后，加入2.5%戊二醛固定液固定，置 4 ℃冰箱過夜后，按照電鏡常規(guī)標本制作方法制成超薄切片，然后在透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.9 CCK-8檢測各組細胞增殖情況 在96孔板中配置100 μl的PASMCs懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(在37 ℃，5%CO2的條件下)，向培養(yǎng)板加入10 μl不同濃度的待測物質(zhì)；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24 h，然后每孔加入10 μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，最后用酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.10 細胞熒光流式細胞儀檢測各組細胞增殖情況 取PASMCs 1×106/ml，在每一管中分別加入50 μl的組蛋白抗體(HAB)，并充分混勻，于室溫中靜置1 min以上，再直接加入軟件連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應(yīng)，孵育20～60 min后，用PBS(pH 7.2～7.4)洗1～2次，加入緩沖液重懸，上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 細胞的光鏡觀察結(jié)果及生長特點 組織貼塊、倒置干涸法培養(yǎng)PASMCs后的第4天即可見到細胞從組織塊邊緣萌出，呈游離狀，游出細胞漸向外生長，成放射狀排列。細胞形態(tài)呈梭形、魚尾狀，大小略有差異；生長不規(guī)則，對數(shù)生長期的PASMCs，早期單層生長融匯成片，細胞培養(yǎng)10 d后PASMCs層數(shù)增多重疊堆積形成“峰-谷”狀(見圖1)。

2.2 PASMCs的α-SM-actin免疫組化染色結(jié)果 染成棕黃色部分為PASMCs胞質(zhì)，同時可看到肌絲與細胞縱軸成平行排列，細胞核經(jīng)蘇木素染色后呈淡藍色，培養(yǎng)的原代細胞染色結(jié)果陽性率為97%以上(見圖2)。

2.3 PASMCs透射電鏡鑒定結(jié)果 透射電鏡觀察到PASMCs主要呈長梭形，亦呈不規(guī)則形，異染色質(zhì)比較多，胞質(zhì)內(nèi)有與細胞縱軸平行的肌絲，大量胞飲，基膜下有少許密斑和密體，缺乏高爾基體，微絲管沿著胞核呈束狀分布(見圖3)。

2.4 兩組吸光度比較 在細胞孵育時間相同的條件下，加入CCK-8后，COPD模型組PASMCs吸光度(1.079±0.119)高于對照組(0.871±0.041)，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.039，P<0.05)。

2.5 兩組細胞增殖結(jié)果 COPD模型組PASMCs增殖(1.315±0.203)強于對照組(1.023±0.057)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.387，P<0.05)。對照組PASMCs熒光增強(見圖4)。

圖2 PASMCs的α-SM-actin免疫組化染色結(jié)果(×200)

圖3 PASMCs透射電鏡鑒定結(jié)果(×15 000)

注：A 細胞呈梭形或魚尾狀從貼壁組織周圍萌出，B 細胞呈對數(shù)生長，C 細胞部分融合交織成網(wǎng)狀，D 細胞重疊生長成“峰-谷”狀

圖1 PASMCs光鏡觀察結(jié)果及生長特點(×100)

Figure1 Growth characteristics of cells by light microscopy observations

注：A COPD模型組PASMCs增殖增強、熒光減弱，B 對照組PASMCs增殖減弱、熒光增強

3 討論

PASMCs是構(gòu)成肺動脈的主要結(jié)構(gòu)，具有增殖等功能。PASMCs的結(jié)構(gòu)和功能是決定肺血管動力學的主要因素之一[6]。目前，對PASMCs的結(jié)構(gòu)及其功能的研究日益受到重視。COPD是一常見病、多發(fā)病，但其發(fā)病機制較復(fù)雜。PASMCs的異常增殖和遷移是COPD繼發(fā)肺動脈高壓的基本病理生理學改變，并影響患者的預(yù)后及生活質(zhì)量[7]。研究報道，COPD患者的肺動脈管壁增厚、管腔變窄，其結(jié)構(gòu)與正常人不同[8]。目前，國內(nèi)外關(guān)于原代培養(yǎng)大鼠 PASMCs方法的報道較多，但是，當前從細胞水平上對COPD患者與正常人的功能對比研究報道較少。本實驗從動物模型體內(nèi)提取PASMCs進行體外培養(yǎng)，并研究兩者的生物學特性及功能差異。

目前普遍認為：長期顯露于香煙煙霧環(huán)境下，易誘發(fā)COPD[9]；在慢性炎癥或低氧條件下，PASMCs會出現(xiàn)增殖性改變，繼而發(fā)生肺血管重塑，最終發(fā)生肺動脈高壓[10]。本實驗通過從COPD模型組及對照組大鼠中提取、原代培養(yǎng)出PASMCs，經(jīng)細胞免疫組化染色及透射電鏡等鑒定為實驗所需的PASMCs，陽性率在97%以上。研究中發(fā)現(xiàn)，COPD模型組大鼠與對照組大鼠PASMCs用同種方法培養(yǎng)后在顯微鏡下觀察，組織貼壁后都呈放射性生長或似“火山爆發(fā)”樣，長出細胞呈長棱形或“魚尾”狀，細胞多層重疊后高低起伏似“峰-谷”狀，一般都是在組織貼壁后3～4 d開始長出細胞，與國內(nèi)相關(guān)文獻報道的關(guān)于PASMCs原代培養(yǎng)生長特性相似，說明兩者形態(tài)及生長特性無差異；增殖與示蹤檢測PASMCs的生長曲線發(fā)現(xiàn)，COPD模型組PASMCs增殖高于對照組，表明COPD組PASMCs與對照組功能不同。

原代細胞培養(yǎng)是一件較難、較復(fù)雜的實驗，本實驗采用從COPD模型大鼠體內(nèi)取出組織進行體外原代細胞培養(yǎng)，并取得成功，對照組與COPD模型組原代培養(yǎng)的PASMCs形態(tài)學相似，但生物學特性不同，功能亦存在差異，原代培養(yǎng)肺動脈平滑肌細胞可為COPD繼發(fā)肺動脈高壓發(fā)病機制及藥物防治研究提供更具有代表性的實驗研究對象及研究數(shù)據(jù)。同時發(fā)現(xiàn)組織貼壁法簡便易行、經(jīng)濟快捷、重復(fù)性好、成功率高，能獲得高純度、活性強的原代細胞，完全可以滿足各類相關(guān)實驗的需要，為從細胞水平對血管性疾病進行體外實驗奠定了基礎(chǔ)和提供了有價值的實驗材料，值得推廣。

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