王偉文，廖曉陽(yáng)，王 建，楊正輝，劉 榆

癲癇是一種因大腦局部神經(jīng)元過(guò)度興奮而導(dǎo)致的異常放電及臨床發(fā)作為特征的病理狀況。紋狀體、海馬是與癲癇發(fā)作密切相關(guān)的主要結(jié)構(gòu)，而多巴胺在其中扮演著重要角色[1-2]。抗精神病藥物(D2受體阻斷劑)所導(dǎo)致個(gè)體發(fā)生癲癇的易患性增高應(yīng)該與多巴胺的作用有關(guān)[3]。致癇藥物戊四氮(PTZ)常被用于誘導(dǎo)成年大鼠全身性癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)模型的制作。然而，迄今為止關(guān)于多巴胺及其相應(yīng)受體在PTZ誘導(dǎo)的癲癇模型中是起抑制作用還是激動(dòng)作用尚不清楚。即刻早期基因產(chǎn)物Fos在神經(jīng)元的表達(dá)能充分反映活性神經(jīng)元的分布，因此多年以來(lái)就被研究者廣泛用作標(biāo)記活性神經(jīng)元的標(biāo)記物[4]。另有研究結(jié)果提示，F(xiàn)os在化學(xué)藥物誘導(dǎo)的癲癇模型中表達(dá)數(shù)量與癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[5]。本研究是在重復(fù)給予低劑量PTZ誘導(dǎo)的大鼠SE模型中，通過(guò)給予多巴胺選擇性地激動(dòng)D1受體或用SCH23900選擇性地阻斷D1受體后對(duì)誘導(dǎo)大鼠相同癲癇發(fā)作分級(jí)所需PTZ劑量的比較及與前腦Fos表達(dá)的半定量檢測(cè)的聯(lián)系來(lái)進(jìn)一步明確多巴胺及其受體在癲癇發(fā)作中所扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 二級(jí)健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量210～240 g，購(gòu)于四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 PTZ和SCH23900(D1受體阻斷劑)購(gòu)于英國(guó)Sigma公司，左旋多巴(L-Dopamine)和舒必利(sulpiride,D2受體阻滯劑)購(gòu)于上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組10只。(1) PTZ組大鼠僅接受重復(fù)低劑量的PTZ誘導(dǎo)SE發(fā)作，發(fā)作2 h后處死；(2) LSP組大鼠首先接受舒必利(20 mg/kg)腹腔注射，15 min后再被給予左旋多巴(50 mg/kg)腹腔注射，15 min后接受重復(fù)低劑量的PTZ誘導(dǎo)SE發(fā)作，發(fā)作2 h后處死；(3) LSSP組大鼠首先接受舒必利(20 mg/kg)+SCH23990(0.75 mg/kg)腹腔注射，15 min后再接受左旋多巴(50 mg/kg)腹腔注射，15 min接受重復(fù)低劑量的PTZ誘導(dǎo)SE發(fā)作，發(fā)作2 h后處死；(4)對(duì)照組大鼠接受與PTZ組相同次數(shù)相同體積的0.9%氯化鈉溶液注射，并在注射完畢2 h后處死。

1.2.2 癲癇模型的制備及發(fā)作分級(jí)尺度的建立

1.2.2.1 癲癇模型制備 各實(shí)驗(yàn)組大鼠均接受重復(fù)低劑量的PTZ腹腔注射誘導(dǎo)SE發(fā)作。注射方案：首劑按20 mg/kg PTZ腹腔注射，然后每間隔10 min按10 mg/kgPTZ腹腔注射直至SE發(fā)生。SE發(fā)作特征：大鼠出現(xiàn)連續(xù)的強(qiáng)直跌倒發(fā)作，時(shí)間10～15 s；而后幾分鐘反復(fù)出現(xiàn)頭、頸、軀干及四肢的陣攣性發(fā)作[7]。大鼠在SE發(fā)作后被放回溫暖(20 ℃)、安靜環(huán)境中飼養(yǎng)，在發(fā)作2 h后處死[6]。

本文創(chuàng)新點(diǎn)——紋狀體、海馬是與癲癇發(fā)作密切相關(guān)的大腦結(jié)構(gòu)，而多巴胺在其中扮演著重要角色。以往的實(shí)驗(yàn)性癲癇模型中，多巴胺對(duì)癲癇發(fā)作的發(fā)生、發(fā)展是起促進(jìn)作用還是抑制作用尚存在爭(zhēng)議。而關(guān)于多巴胺及其相應(yīng)受體在戊四氮誘導(dǎo)的癲癇模型中所起的作用尚不清楚。本研究是在重復(fù)給予低劑量戊四氮誘導(dǎo)的大鼠全身性癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)模型中，通過(guò)給予多巴胺選擇性地激動(dòng)D1受體或用SCH23900選擇性地阻斷D1受體后對(duì)誘導(dǎo)大鼠癲癇發(fā)作各分級(jí)所需戊四氮?jiǎng)┝康谋容^及其與前腦Fos表達(dá)的半定量檢測(cè)的聯(lián)系分析，從行為學(xué)觀察和形態(tài)學(xué)檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步明確多巴胺及其受體在癲癇發(fā)作中所扮演的角色。結(jié)果提示：多巴胺激動(dòng)D1受體對(duì)戊四氮誘導(dǎo)的SE發(fā)作有促驚厥作用，并貫穿于癲癇的發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程。

1.2.2.2 發(fā)作分級(jí)尺度的建立 大鼠SE發(fā)作嚴(yán)重程度根據(jù)Raccine制定標(biāo)準(zhǔn)來(lái)分級(jí)[7]，即：0級(jí)，無(wú)反應(yīng)；1級(jí)，耳、面部顫搐；2級(jí)，全身性波浪狀痙攣；3級(jí)，肌陣攣性抽搐或后肢抽搐及豎尾；4級(jí)，向一側(cè)傾倒；5級(jí)，軀體翻轉(zhuǎn)伴全身性陣攣-強(qiáng)直性發(fā)作。每次PTZ腹腔注射后，記錄注射間隔期10 min內(nèi)的最高發(fā)作分級(jí)。

1.2.3 切片制備 大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射深度麻醉后，予以左心室至升主動(dòng)脈插管，含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH 7.4)灌流固定，腦組織在冷凍切片機(jī)上行全腦連續(xù)冠狀切片，收集25 μm厚的組織切片用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 各實(shí)驗(yàn)組大鼠全腦系列切片行免疫組織化學(xué)染色(ABC法)，首先一抗(兔抗Fos，Vector，1∶8 000) 4 ℃孵育48 h；其次二抗(驢抗兔生物素標(biāo)記的IgG，Check,1∶500)室溫孵育8 h；最后ABC復(fù)合物(Vector,1∶500)室溫下孵育2 h，DAB-葡萄糖氧化酶-硫酸鎳胺加強(qiáng)法呈色反應(yīng)20～30 min,組織切片上可見藍(lán)色的陽(yáng)性產(chǎn)物，切片經(jīng)晾干、脫水、透明后封片。在Olympus BX-60顯微鏡下分析觀察結(jié)果，并采集圖像。對(duì)照組中用正常兔血清替代一抗，余染色步驟同前。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 各組誘導(dǎo)不同程度癲癇發(fā)作所用PTZ累積劑量，計(jì)算平均數(shù)。免疫組織化學(xué)染色觀察各組位于大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體區(qū)域的陽(yáng)性Fos神經(jīng)元，每只大鼠每個(gè)區(qū)域挑選8～10張切片(雙側(cè))用以計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PTZ組、LSP組、LSSP組誘導(dǎo)不同程度癲癇發(fā)作所用PTZ累積劑量比較 PTZ組、LSP組、LSSP組誘導(dǎo)不同程度癲癇發(fā)作所用PTZ累積劑量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中LSP組較PTZ組和LSSP組用量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PTZ組與LSSP組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組組內(nèi)比較，誘導(dǎo)不同級(jí)別的癲癇發(fā)作所用PTZ累積劑量間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同癲癇發(fā)作分級(jí)間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。對(duì)照組大鼠均無(wú)癲癇發(fā)作。

2.2 Fos在大鼠皮質(zhì)、海馬及紋狀體區(qū)域的表達(dá) SE發(fā)作2 h后，中-高密集度的Fos在大鼠前腦區(qū)域廣泛表達(dá)，藍(lán)黑色的陽(yáng)性Fos圓形產(chǎn)物均獨(dú)特地定位于細(xì)胞核上(見圖1a′,b′,c′)。在皮質(zhì)，F(xiàn)os主要表達(dá)分布于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ層(見圖1a)；而在海馬的CA2、CA3及齒狀回區(qū)是Fos表達(dá)的密集區(qū)(見圖1b)；在紋狀體Fos呈中等密集度地分布于尾殼核的背內(nèi)側(cè)部(見圖1c)。

2.3 PTZ組、LSP組、LSSP組Fos在皮質(zhì)、海馬及紋狀體表達(dá)數(shù)量比較 SE發(fā)作2 h后，PTZ組、LSP組、LSSP組Fos在皮質(zhì)、海馬及紋狀體表達(dá)數(shù)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，在重復(fù)給予低劑量PTZ所誘導(dǎo)的大鼠SE模型中，誘導(dǎo)不同癲癇發(fā)作分級(jí)與所用PTZ累積劑量間存在著劑量依賴關(guān)系。誘導(dǎo)癲癇發(fā)作分級(jí)越高，所需PTZ的劑量越大。多巴胺對(duì)D1受體的促進(jìn)作用可以減少誘導(dǎo)同等癲癇發(fā)作分級(jí)所用PTZ的劑量，多巴胺在PTZ誘導(dǎo)的癲癇模型中具有促進(jìn)驚厥發(fā)作的作用。

以往的實(shí)驗(yàn)性癲癇模型中，多巴胺對(duì)癲癇發(fā)作的發(fā)生、發(fā)展是其促進(jìn)作用還是抑制作用尚存在爭(zhēng)議[8]。如Barone等[9]提出，在顳葉癲癇動(dòng)物模型中多巴胺對(duì)癲癇發(fā)作的行為學(xué)改變并不明顯，但腦電監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示有促驚厥作用。本研究結(jié)果顯示多巴胺選擇性地激動(dòng)D1受體對(duì)PTZ誘導(dǎo)的大鼠癲癇發(fā)作有促進(jìn)作用。不論是起始階段小劑量PTZ所誘導(dǎo)的輕微發(fā)作(1級(jí))，還是后續(xù)PTZ累積所致的全面強(qiáng)直發(fā)作(5級(jí))，多巴胺的介入均可使誘導(dǎo)發(fā)作的PTZ劑量減低，而D1受體阻滯劑SCH23900可以阻斷這種效應(yīng)。這一結(jié)果從行為學(xué)角度提示了多巴胺通過(guò)作用D1受體在癲癇的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的促驚厥作用。

表1 PTZ組、LSP組、LSSP組誘導(dǎo)不同程度癲癇發(fā)作所用PTZ累積劑量比較只)

注：與LSP組比較，*P<0.05；與1級(jí)比較，△P<0.05；與2級(jí)比較，▲P<0.05；與3級(jí)比較，☆P<0.05；與4級(jí)比較，★P<0.05

注：a皮質(zhì)(免疫組織化學(xué)染色，×40)、a′皮質(zhì)(免疫組織化學(xué)染色，×400)，b海馬(免疫組織化學(xué)染色，×40)、b′海馬(免疫組織化學(xué)染色，×400)，c紋狀體(免疫組織化學(xué)染色，×40)、c′紋狀體(免疫組織化學(xué)染色，×400)

圖1 SE發(fā)作2 h后Fos在前腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體的表達(dá)分布

Figure1 The distribution of Fos expression in cerebral cortex,hippocampus and corpus striatum at 2 hours after the onset of SE

Table2 Comparison of quantity of Fos in cerebral cortex,hippocampus and corpus striatum in PTZ group,LSP group and LSSP group

組別只數(shù)皮質(zhì)海馬紋狀體PTZ組101099±200274±59209±61LSP組101113±230291±63239±53LSSP組101052±215286±43219±50F值013905970413P值087105580666

即刻早期基因產(chǎn)物Fos在神經(jīng)元的表達(dá)能充分反映活性神經(jīng)元的分布，并且Fos表達(dá)的數(shù)量在化學(xué)藥物誘導(dǎo)的癲癇模型中與癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度呈正比[10]。長(zhǎng)期以來(lái)，眾多神經(jīng)科學(xué)者認(rèn)為紋狀體、海馬是與癲癇活性密切相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)，但各自在癲癇發(fā)作中所扮演的角色尚不清楚。本研究在PTZ誘導(dǎo)的癲癇模型中，通過(guò)對(duì)Fos在大鼠皮質(zhì)、海馬及紋狀體表達(dá)分布情況分析顯示，在皮質(zhì)，海馬的CA2、CA3，紋狀體尾殼核的背內(nèi)側(cè)部均有高密集度的表達(dá)，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了皮質(zhì)、海馬和紋狀體是癲癇起源、擴(kuò)展的重要結(jié)構(gòu)組成。因此，多巴胺對(duì)D1受體的激動(dòng)作用同樣對(duì)PTZ誘導(dǎo)的Fos表達(dá)有促進(jìn)作用，本結(jié)果從形態(tài)學(xué)角度為多巴胺作用D1受體而參與對(duì)癲癇發(fā)作的調(diào)節(jié)提供了又一支持點(diǎn)。

總之，多巴胺激動(dòng)D1受體在PTZ誘導(dǎo)的大鼠SE模型中，通過(guò)對(duì)癲癇發(fā)作分級(jí)及大鼠前腦區(qū)域Fos的表達(dá)分析結(jié)果顯示，無(wú)論從行為學(xué)還是形態(tài)學(xué)角度都提示多巴胺激動(dòng)D1受體對(duì)PTZ誘導(dǎo)的SE有促驚厥作用，并貫穿于癲癇發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程。

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