馮 莉，韓 晶，左 靜，呂雅蕾，王玉棟，劉 巍

結(jié)直腸癌是目前最常見的消化道腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢，是威脅人類健康的重要疾病。以手術(shù)為主的綜合治療是結(jié)直腸癌的主要治療方法，化療為重要輔助治療，其中氟尿嘧啶(5-Fu)為結(jié)直腸癌化療的重要藥物，因此5-Fu的敏感性成為可能影響預(yù)后的重要因素，值得關(guān)注。近年來報道胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)與5-Fu敏感性存在相關(guān)性，并可能與預(yù)后相關(guān)。為此，本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測93例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者腫瘤組織TS表達(dá)情況，并應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測腫瘤組織對5-Fu的敏感性，以探討TS與5-Fu敏感性的關(guān)系及與臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2006年10月—2009年4月收治的病理明確的行結(jié)直腸癌根治術(shù)的Ⅰ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者93例(Ⅳ期結(jié)直腸癌均合并肝轉(zhuǎn)移，肝臟病灶一同切除)為研究對象，其中男41例，女52例；年齡22～81歲，中位年齡 63歲；TNM分期參照2009年第七版《AJCC腫瘤分期手冊》，其中Ⅰ期15例，Ⅱ期32例，Ⅲ期41例，Ⅳ期5例。排除臨床合并其他惡性腫瘤或臨床病理特征不完整的患者?；颊咝g(shù)前均未行放化療；Ⅰ期患者術(shù)后未行化療，Ⅱ～Ⅳ期的78例患者中73例術(shù)后應(yīng)用5-Fu為基礎(chǔ)的化療。無病生存期(DFS)定義為根治性治療到腫瘤復(fù)發(fā)或因各種原因出現(xiàn)死亡的時間，腫瘤藥物咨詢委員會(ODAC)一致認(rèn)為DFS延長代表著臨床獲益，故以DFS為研究終點(diǎn)。對所有患者進(jìn)行隨訪，隨訪方式：門診復(fù)查、電話隨訪。隨訪終點(diǎn)：隨訪截止日期2011-09-30、出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移日期、因其他原因死亡日期、失訪日期。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法

1.2.1.1 主要試劑 TS兔抗人抗體、SP免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色系統(tǒng)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2.1.2 步驟 調(diào)取所有患者于我院病理科保存完整的病理蠟塊，重新切片并應(yīng)用SP法進(jìn)行免疫組化染色。SP法：取蠟塊切成4 μm厚切片，烘烤60 min；經(jīng)二甲苯脫蠟至梯度乙醇脫水(室溫完成)；抗原修復(fù)；3%過氧化氫(H2O2)滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min ×3次；正常羊血清工作液封閉10 min，滴加一抗(用PBS代替一抗做陰性對照，hMLH1、hMSH2抗體稀釋1∶200)，0.01 mol/L PBS沖洗2 min×3次；滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育20 min，0.01 mol/L PBS沖洗2 min ×3次；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育25 min，0.01 mol/L PBS沖洗2 min×3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染；烤干，中性樹膠封固。

1.2.1.3 結(jié)果判斷 TS免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色的陽性顆粒為陽性表現(xiàn)，選取4個具有代表性的高倍視野計算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<5%為(-)，5%～25%(+)，26%～50%(++)，51%～75%(+++)，>75%為(++++)。(++)及以上為陽性高表達(dá)。

1.2.2 MTT法檢測敏感性

1.2.2.1 主要試劑 MTT 液(美國 Sigma 公司)，完全培養(yǎng)液 RPMI 1640(美國 Gibco 公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)，二甲基亞砜(DMSO)(北京化工廠)，5-Fu(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。

1.2.2.2 實驗步驟 (1)制單細(xì)胞懸液：取腫瘤組織約1 g，0.9%氯化鈉溶液漂洗×2次，剪碎，放入 0.25%胰蛋白酶消化液，經(jīng) 200 目細(xì)胞篩過濾，制成單細(xì)胞懸液。用已配置的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液配制成單個細(xì)胞懸液；經(jīng)苔盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×105/ml接種于96 孔板，100 μl/孔。(2)加板：設(shè)實驗組、對照組和空白組。實驗組加入5-Fu單藥，每孔20 μl ；對照組加入等量培養(yǎng)液；空白組不加細(xì)胞懸液，只加入對照PBS。根據(jù)臨床常規(guī)用藥劑量,參考公式 log(PPC)=-0.788+[0.755×log(LD50)][1]，得出試驗設(shè)定藥物濃度：5-FU 2.5 μg/ml。(3)MTT比色分析：將培養(yǎng)板置于 37 ℃、5%二氧化碳(CO2)環(huán)境中培養(yǎng) 48 h 后，各培養(yǎng)孔加 5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清液，每孔加 DMSO 150 μl 輕輕振蕩混勻使甲臜充分溶解后，用酶標(biāo)儀測定各孔的光密度(OD)值，K=570 nm。重復(fù)3次并計算抑制率(CI)。

1.2.2.3 結(jié)果判斷 藥物敏感試驗結(jié)果判斷：計算公式：CI=(對照組 OD 值-給藥組 OD 值)/對照組 OD 值×100%。結(jié)果判定：CI≥30%為敏感；CI<30%為不敏感。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，TS表達(dá)與5-Fu敏感性、臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗；Kaplan-Meier生存曲線比較采用Log-Rank檢驗，影響預(yù)后因素分析采用Cox風(fēng)險回歸模型。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果 截至2011-09-30，共隨訪到90例患者，3例失訪，隨訪率為96.8%，失訪患者按照截尾值處理。隨訪患者中，44例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

2.2 TS高表達(dá)率與低表達(dá)率 93例患者中57例患者TS為低表達(dá)，低表達(dá)率為61.3%；36例患者為TS高表達(dá)，高表達(dá)率為38.7%。

2.3 TS表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系 TS表達(dá)與年齡及hMLH1、hMSH2蛋白表達(dá)情況相關(guān)(P<0.05)，而TS表達(dá)與性別、腫瘤大體類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分期無相關(guān)性(P>0.05，見表1)。

2.4 TS表達(dá)情況與5-Fu敏感性的關(guān)系 TS高表達(dá)與TS低表達(dá)5-Fu敏感性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.5 生存分析

2.5.1 單因素分析 Kaplan-Meier生存曲線Log-Rank檢驗及單因素分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、hMLH1和hMSH2蛋白表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者DFS有關(guān)(P<0.05)；年齡、性別、腫瘤大體類型、浸潤深度、TS表達(dá)情況、5-Fu敏感性與結(jié)直腸癌患者DFS無相關(guān)性(P>0.05，見表3、圖1)。

2.5.2 多因素分析 將單因素生存分析中P<0.10的因素納入Cox多因素生存分析，即將腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(因分期有T、N、M 3方面決定，故剔除分期)、hMLH1和hMSH2蛋白表達(dá)情況、TS 5項納入分析，結(jié)果提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、hMLH1和hMSH2蛋白表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者DFS有回歸關(guān)系(P<0.05，見表4)。

表1 TS高表達(dá)與TS低表達(dá)患者臨床病理特征比較〔n(%)〕

Table1 Comparison of clinical pathological features between patients with high and low TS expression

因素TS高表達(dá)(n=36)TS低表達(dá)(n=57)χ2值P值性別0.2340.628 男17(47.2)24(42.1) 女19(52.8)33(57.9)年齡(歲)7.3420.007 ≥705(13.9)23(40.4) <7031(86.1)34(59.6)腫瘤大體類型*1.4920.474 潰瘍型17(54.8)34(65.4) 隆起型11(35.5)12(23.1) 浸潤型3(9.7)6(11.5)浸潤深度0.3090.578 T1～38(22.2)10(17.5) T428(11.8)47(82.5)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1.4600.482 N017(47.2)30(52.6) N112(33.3)21(36.9) N27(19.5)6(10.5)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移0.1690.681 M035(97.2)53(93.0) M11(2.8)4(7.0)分期1.1590.763 Ⅰ期7(19.4)8(14.0) Ⅱ期12(33.3)20(35.1) Ⅲ期16(44.5)25(43.9) Ⅳ期1(3.8)4(7.0)hMLH1和hMSH2蛋白表達(dá)4.6530.031 hMLH1和hMSH2蛋白均陽性27(75.0)30(52.6) hMLH1和/或hMSH2蛋白陰性9(25.0)27(47.4)

注:*部分例數(shù)缺失；TS=胸苷酸合成酶

表2 TS高表達(dá)與TS低表達(dá)患者5-Fu敏感性比較〔n(%)〕

Table2 Comparison of sensitivity to fluorouracil between patients with high and low TS expression

TS例數(shù)敏感不敏感高表達(dá)3634(94.4) 2(5.6) 低表達(dá)5745(78.9)12(21.1)χ2值4.144P值0.042

表3 結(jié)直腸癌患者臨床病理特征與DFS關(guān)系的單因素分析

Table3 Cox univariate analysis on relationship between clinical pathological features and DFS

因素RR值95%CIP值年齡(歲)0.381 <701 ≥70 1.336 (0.707,2.526)性別0.950 男1 女 1.019 (0.565,1.838)腫瘤大體類型0.968 潰瘍型1 隆起型 1.078 (0.543,2.141)0.831 浸潤型 1.107 (0.381,3.219)0.852浸潤深度0.076 未侵透漿膜(T1～3)1 侵透漿膜(T4) 1.926 (0.889,4.174)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.001 N01 N1 3.272 (1.677,6.381)0.001 N2 3.542 (1.362,9.215)0.010遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移0.011 M01 M1 7.501 (2.154,26.128)TNM分期0.000 Ⅰ期1 Ⅱ期 1.246 (0.502,3.092)0.635 Ⅲ期 3.852 (1.547,9.594)0.004 Ⅳ期13.928(3.775,71.298)0.000hMLH1和hMSH2蛋白表達(dá)情況0.000 hMLH1和hMSH2蛋白均陽性1 hMLH1和/或hMSH2蛋白陰性 3.499 (1.785,6.859)TS表達(dá)情況0.068 低表達(dá)1 高表達(dá) 1.785 (0.967,3.292)5-Fu敏感性0.443 不敏感1 敏感 0.719 (0.319,1.620)

注：5-Fu=氟尿嘧啶

注：A hMLH1和/或hMSH2蛋白陰性與hMLH1和hMSH2蛋白均陽性患者的無病生存率對比，B無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的無病生存率對比，C不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的無病生存率對比，D不同TNM分期患者的無病生存率對比

圖1 不同臨床病理特征患者無病生存率對比

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤發(fā)病和死亡構(gòu)成中分別占10.56%和7.80%，居第3位和第5位[2-3]。多年來臨床病理分期為判斷患者預(yù)后的惟一標(biāo)準(zhǔn)，但近期發(fā)現(xiàn)除臨床病理分期等特征外，仍存在其他可能影響預(yù)后的生物標(biāo)志物，TS為其中之一[4-5]。

TS是葉酸代謝途徑中起中心作用的酶類之一，其在5,10-亞甲基四氧葉酸(5，10-MTHF)的存在下，將脫氧鳥苷酸轉(zhuǎn)變成脫氧胸苷酸，這是細(xì)胞合成和修復(fù)所需要的胸苷酸的惟一來源。因此如果對腫瘤細(xì)胞的TS進(jìn)行抑制，便可使腫瘤細(xì)胞內(nèi)胸苷酸減少，造成染色體斷裂，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞造成殺傷作用[6]。TS是5-Fu作用的靶酶[7-8]，故理論上TS的表達(dá)情況會影響5-Fu的藥物敏感性，進(jìn)而可能影響應(yīng)用5-Fu治療患者的預(yù)后。國內(nèi)外多名學(xué)者已經(jīng)對TS表達(dá)與應(yīng)用5-Fu治療結(jié)直腸癌患者的預(yù)后進(jìn)行過探討。Karlberg等[9]發(fā)現(xiàn)，對于進(jìn)行根治術(shù)的Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者，TS高表達(dá)者總生存期較短，即TS表達(dá)水平是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的預(yù)測因素。我國學(xué)者余之剛等[10]對134例Ⅰ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，TS低表達(dá)者5年生存率較高表達(dá)者延長。但Arrazubi等[11]卻認(rèn)為，TS的表達(dá)受到多因素的調(diào)節(jié)，單純應(yīng)用TS表達(dá)預(yù)測5-Fu治療后結(jié)直腸癌患者的預(yù)后是不充分的。

國內(nèi)外學(xué)者并未對TS表達(dá)能否預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后得出一致結(jié)論。為避免樣本量不足及所納入的研究人群的差異而導(dǎo)致研究結(jié)果的不同，Popat等[12]進(jìn)行了更具有說服力的Meta分析，納入研究包括局限期和進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TS高表達(dá)患者較低表達(dá)者預(yù)后更差，尤其是進(jìn)展期結(jié)直腸癌的生存差異更為顯著。然而我國學(xué)者Chen等[13]發(fā)表的Meta分析卻未發(fā)現(xiàn)TS表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)。關(guān)于TS表達(dá)能否預(yù)測結(jié)直腸癌患者的預(yù)后仍在進(jìn)一步研究，未達(dá)成統(tǒng)一結(jié)論，但即使目前不能充分肯定TS能直接預(yù)測結(jié)直腸患者預(yù)后，對于TS預(yù)測預(yù)后的價值仍是值得肯定的，其可能與其他生物標(biāo)志物聯(lián)合預(yù)測預(yù)后。本研究結(jié)果顯示TS表達(dá)水平并不能像淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、hMLH1及hMSH2蛋白表達(dá)一樣具有預(yù)測預(yù)后的價值。再次證實了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、hMLH1及hMSH2蛋白表達(dá)具有預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后的價值，具有可信性。但同時顯示TS對預(yù)后沒有預(yù)測價值，可能與本研究樣本量較小有關(guān)，因此TS預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后的價值需要得到重視，還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗證。

關(guān)于TS與5-Fu敏感性的研究也不在少數(shù)，但報道結(jié)果不一致，多數(shù)國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為TS高表達(dá)的患者與5-Fu耐藥有關(guān)，但也有少數(shù)學(xué)者認(rèn)為TS高表達(dá)患者易對5-Fu敏感。Subbarayan等[14]研究發(fā)現(xiàn)TS高表達(dá)的患者更易對5-Fu耐藥。我國學(xué)者陳新等[15]對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行體外藥敏實驗，研究發(fā)現(xiàn)TS高表達(dá)的腫瘤組織對5-Fu敏感性明顯低于TS低表達(dá)腫瘤組織。但Páez等[16]通過對1998—2007年的51例使用5-Fu為基礎(chǔ)新輔助化療的Ⅱ/Ⅲ期直腸癌患者回顧性研究發(fā)現(xiàn)，TS 3R/3R基因型(TS高表達(dá))與較高的反應(yīng)率相關(guān)。因此，目前關(guān)于TS與5-Fu敏感性的關(guān)系仍眾說紛紜，分析各項研究得出TS與5-Fu敏感性的關(guān)系結(jié)論不一，可能有以下原因：(1)所選擇的患者來自不同的人群，各人群具有相對不同的臨床病理特征，而這些臨床病理特征也有可能是5-Fu敏感性的影響因素，因此可能摻雜了其他對5-Fu敏感性有影響的因素，導(dǎo)致結(jié)果的偏差；(2)樣本量不足，選擇人群的結(jié)果不能真實反映總體的情況；(3)不同研究所選取的檢測5-Fu敏感性的方法不同，可能導(dǎo)致引起結(jié)果偏差；(4)檢測TS表達(dá)水平也有很多方法，有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法測TS mRNA 水平，免疫組化法檢測TS蛋白表達(dá)情況以及根據(jù)基因多態(tài)性推斷TS蛋白水平等多種方法，不同方法檢測的一致性尚無明確答案，因此也可能導(dǎo)致不同研究TS水平的檢測差異。

本研究結(jié)果顯示TS高表達(dá)的患者對5-Fu敏感性更高，與預(yù)后無明顯相關(guān)性，主要考慮到本研究的樣本量尚不足，且是單中心的回顧性研究，仍存在不足之處，因此需要更大樣本的前瞻性研究進(jìn)一步探討。

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