黃 輝

牙周炎是一種由于細(xì)菌侵犯牙齦和牙周組織而引起的慢性炎癥，其主要特征為牙周袋的形成及袋壁的炎癥，牙槽骨吸收和牙齒逐漸松動(dòng)[1]。牙周炎在糖尿病人群中發(fā)病率較高[2]，已被認(rèn)為是糖尿病的第六大并發(fā)癥[3]。羅格列酮通過與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)結(jié)合而發(fā)揮作用，除了具有治療2型糖尿病[4]的功能之外，還可減輕急性、慢性炎癥反應(yīng)[5]。因此，本研究將對(duì)羅格列酮在糖尿病牙周炎大鼠牙周組織中的炎癥抑制效應(yīng)進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 馬來酸羅格列酮片(文迪雅)由葛蘭素史克(天津)有限公司提供，批號(hào) 06070021。試劑鏈脲佐菌素(批號(hào)040103)、GW9662(PPAR-γ特異拮抗劑)購自Sigma公司；細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)及血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購自美國R&D公司。兔抗人actin多克隆抗體、兔抗人PPAR-γ多克隆抗體、兔抗人核因子κB(NF-κB)多克隆抗體、羊抗兔二抗及ECL顯影劑均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 選用純種雄性6月齡SD大鼠40只(廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量(236±13)g。以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病牙周炎組、羅格列酮組及羅格列酮+GW9662組，每組10只。除對(duì)照組外，其余各組大鼠按55 mg/kg體質(zhì)量腹腔一次性注射鏈脲佐菌素溶液，確定空腹血糖>16.7 mmol/L糖尿病動(dòng)物模型建立。1周后1%戊巴比妥鈉麻醉下用直徑0.2 mm的正畸鋼絲結(jié)扎右側(cè)上頜第一磨牙頸部，并喂黏性食料。結(jié)扎術(shù)后4周，臨床觀察見右上頜第一、二磨牙間牙齦紅腫糜爛；動(dòng)物組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)結(jié)合上皮與牙體分離，膠原纖維排列紊亂，牙槽嵴頂破壞吸收，確認(rèn)牙周炎動(dòng)物模型建立。糖尿病牙周炎動(dòng)物模型建立后第1天起，對(duì)照組予10%二甲基亞砜(DMSO)2 ml/kg；糖尿病牙周炎組予DMSO 2 ml/kg；羅格列酮組予羅格列酮3 mg/kg,羅格列酮+GW9662組予羅格列酮3 mg/kg+GW9662 0.3 mg/kg,灌胃1次/d，連續(xù)1周。1周后處死大鼠，取牙齦組織，稱質(zhì)量，分別用于相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè)及免疫組織切片的制備，剩余部分置液氮中保存。

1.3 牙槽骨骨吸收度測(cè)量 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死大鼠后，截取包括實(shí)驗(yàn)區(qū)磨牙的雙側(cè)上頜骨，置于10%中性甲醛溶液中，固定后脫鈣，制作石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，德國DMR+Q550病理圖像分析儀測(cè)量釉牙骨質(zhì)界(CEJ)至第一磨牙近中牙槽嵴頂(A)的垂直距離(CEJ-A)，取5張切片的平均值。

1.4 牙齦組織多形核中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(PMNs) 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死大鼠后，迅速切下牙齦組織，冰0.9%氯化鈉溶液洗凈后，置于10%中性甲醛溶液中固定12 h，常規(guī)石蠟包埋。3 μm厚切片，HE染色。觀察高倍鏡下(×400)牙齦結(jié)締組織及上皮組織共20個(gè)視野，視野范圍內(nèi)計(jì)數(shù)浸潤(rùn)的PMNs，取平均值。

1.5 牙齦組織ICAM-1及VCAM-1含量測(cè)定 取每只大鼠牙周組織，用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，吸干水分，稱質(zhì)量，按每0.1 g牙周組織加磷酸鹽緩沖液(PBS)1.5 ml稀釋，勻漿后，離心取上清液，置-80 ℃冰箱凍存?zhèn)錂z。ELISA法檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牙齦組織上清液蛋白含量。計(jì)算出每克蛋白ICAM-1及VCAM-1含量。

1.6 Western blotting測(cè)定NF-κB及PPAR-γ 取牙齦組織，液氮凍存。提取總蛋白并按Pierce BCA蛋白定量試劑盒說明書操作，取細(xì)胞溶解液蛋白50 μg在80 g/L的十二烷基苯磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，冰上恒壓100 V電轉(zhuǎn)1 h，蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入1∶200稀釋的兔抗人NF-κB抗體以及兔抗人PPAR-γ抗體，4 ℃過夜。TBST緩沖液漂洗后加入1∶400生物素化的羊抗兔二抗，室溫下?lián)u床雜交1 h。TBST漂洗后以ECL化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)放射自顯影。以相同方法測(cè)定內(nèi)參照β-actin的表達(dá)。通過bio-rad gel doc2000圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果,NF-κB、PPAR-γ的表達(dá)水平以NF-κB、PPAR-γ灰度值與β-actin灰度值的相對(duì)值(相對(duì)灰度值)表示。

2 結(jié)果

2.1 各組CEJ-A比較 與對(duì)照組比較，糖尿病牙周炎組、羅格列酮組及羅格列酮+GW9662組CEJ-A增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與羅格列酮組比較，糖尿病牙周炎組及羅格列酮+GW9662組CEJ-A增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2 各組牙齦組織PMNs比較 與對(duì)照組比較，糖尿病牙周炎組、羅格列酮組及羅格列酮+GW9662組PMNs增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與羅格列酮組比較，糖尿病牙周炎組及羅格列酮+GW9662組PMNs增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 各組牙齦組織ICAM-1及VCAM-1含量比較 與對(duì)照組比較，糖尿病牙周炎組、羅格列酮組及羅格列酮+GW9662組ICAM-1及VCAM-1含量增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與羅格列酮組比較，糖尿病牙周炎組及羅格列酮+GW9662組ICAM-1及VCAM-1含量增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.4 各組牙齦組織NF-κB及PPAR-γ比較 與對(duì)照組比較，糖尿病牙周炎組、羅格列酮組及羅格列酮+GW9662組NF-κB表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與羅格列酮組比較，糖尿病牙周炎組及羅格列酮+GW9662組NF-κB表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。羅格列酮組PPAR-γ表達(dá)高于對(duì)照組、糖尿病牙周炎組及羅格列酮+GW9662組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

Table1 Comparison of expressions of CEJ-A,PMNs,ICAM-1 and VCAM-1 in each group

組別只數(shù)CEJ-A(mm)PMNs(個(gè))ICAM-1(ng/g)VCAM-1(ng/g)對(duì)照組100.37±0.02 2.50±1.43 247±27 536±27 糖尿病牙周炎組101.40±0.10*△24.80±2.35*△382±24*△908±49*△羅格列酮組101.05±0.10* 16.10±1.85* 317±35* 751±50* 羅格列酮+GW9662組101.35±0.11*△23.10±2.33*△364±20*△870±64*△F值276.786250.56448.923115.373P值<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001

注：CEJ-A =釉牙骨質(zhì)界至第一磨牙近中牙槽嵴頂?shù)拇怪本嚯x，PMNs=多形核中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，ICAM-1=細(xì)胞間黏附分子1，VCAM-1=血管細(xì)胞黏附分子1；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與羅格列酮組比較，△P<0.05

注：NF-κB=核因子κB，PPAR-γ=過氧化物酶體增殖物激活受體γ；A各組NF-κB的Western blotting結(jié)果，B各組PPAR-γ的Western blotting結(jié)果，C各組NF-κB相對(duì)灰度值比較，D各組PPAR-γ相對(duì)灰度值比較；1為對(duì)照組,2為糖尿病牙周炎組，3為羅格列酮組，4為羅格列酮+GW9662組；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與羅格列酮組比較，△P<0.05

圖1 各組牙齦組織NF-κB及PPAR-γ比較

Figure1 Comparison of expressions of NF-κB and PPAR-γ in gingival tissues in each group

3 討論

糖尿病是牙周炎的危險(xiǎn)因素，同時(shí)牙周炎對(duì)糖尿病的代謝控制亦有不良影響[6]。糖尿病患者體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖生成的氧自由基，不但可直接損傷牙周組織，還可激活NF-κB、蛋白激酶C(PKC)等通路，產(chǎn)生白介素6(IL-6)和ICAM-1等炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而激活破骨細(xì)胞和膠原酶，導(dǎo)致骨與牙周組織破壞[7]，而抑制炎癥反應(yīng)可抑制牙槽骨吸收的速度[8]。在本研究中，也證實(shí)了這一現(xiàn)象，患有糖尿病牙周炎的大鼠CEJ-A要比正常大鼠高；同時(shí)，糖尿病牙周炎組牙齦組織中PMNs、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB均較對(duì)照組增高，這提示糖尿病牙周炎組牙齦組織炎癥反應(yīng)明顯，牙槽骨高度喪失。其機(jī)制可能在于糖尿病牙周炎組NF-κB活性增強(qiáng)，致其下游的炎性細(xì)胞因子ICAM-1及VCAM-1合成增加[9]。由于ICAM-1和VCAM-1的介導(dǎo)，PMNs向炎癥部位的運(yùn)動(dòng)也隨之增強(qiáng)[10]，對(duì)牙齦組織造成進(jìn)一步破壞[11]，最終引起牙槽骨的吸收[12]。

羅格列酮是噻唑烷二酮類藥物，是有效的核轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ的選擇性激動(dòng)劑，與PPAR-γ結(jié)合后，激活PPAR-γ的生物學(xué)作用，從而調(diào)控許多炎癥反應(yīng)，人工合成的PPAR-γ受體激動(dòng)劑可抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(TNF-α)和其他前炎性細(xì)胞因子[13]。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。與糖尿病牙周炎組比較，羅格列酮組可減少ICAM-1、VCAM-1、NF-κB，減少PMNs浸潤(rùn)，表明羅格列酮可緩解糖尿病牙周炎大鼠牙齦組織炎癥反應(yīng)，抑制CEJ-A增高。

本研究觀察到，羅格列酮組PPAR-γ表達(dá)上調(diào)。PPAR-γ配體可能在轉(zhuǎn)錄水平抑制激活蛋白-1(AP-1)和NF-κB活性[14]，因此羅格列酮可能通過上調(diào)PPAR-γ表達(dá)，抑制NF-κB活性，從而下調(diào)趨化因子ICAM-1和VCAM-1表達(dá)，減少PMNs浸潤(rùn)牙齦組織，進(jìn)而抑制牙周組織炎癥對(duì)牙齦組織的破壞，減少牙槽骨的吸收。此外，對(duì)于羅格列酮+GW9662組，由于使用PPAR-γ特異拮抗劑GW9662可拮抗羅格列酮上調(diào)PPAR-γ蛋白的效應(yīng)，因而抑制了羅格列酮在大鼠糖尿病牙周炎的抗炎作用。

綜上所述，在大鼠糖尿病牙周炎模型中，羅格列酮可通過上調(diào)PPAR-γ表達(dá)，抑制NF-κB活性，減少PMNs浸潤(rùn)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)，減少牙槽骨的吸收。但由于動(dòng)物和人體之間的構(gòu)造不同，因而還有待于在臨床上進(jìn)一步探索。

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