鄒浩軍，林莉莉，孫 達(dá)

心腦血管缺血性疾病是臨床常見疾病，具有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高等特點(diǎn)[1-3]，嚴(yán)重?fù)p害人類健康。因此，尋找有效的防治措施至關(guān)重要，如改變生活習(xí)慣、降壓降脂、抗動脈粥樣硬化以及相關(guān)的基因、蛋白調(diào)控，均能有效防治缺血性心腦血管疾病[4]。2008年斯坦福大學(xué)Mochly-Rosen D所領(lǐng)導(dǎo)的課題組首次發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶2(ALDH2)對缺血心臟的保護(hù)作用，明確顯示激活A(yù)LDH2能顯著抑制心肌梗死面積[5]，后期又有研究顯示ALDH2與缺血性腦卒中關(guān)系密切[6]。目前已知的ALDH2激動劑為化合物Adal1,故尋找能提高ALDH2活性的藥物有重要意義。本課題組在研究中偶然發(fā)現(xiàn)質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑(OME)能增加ALDH2活性,其是否能通過提高ALDH2活性而保護(hù)神經(jīng)元呢？本研究利用原代神經(jīng)元缺氧缺糖(OGD)模型，探討OME對原代神經(jīng)元凋亡的影響及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 清潔級SD孕鼠，購自上海斯萊克動物實(shí)驗(yàn)中心，動物合格證號：SCXK(滬)2007-0005；注射用OME(配溶媒)，購自阿斯利康公司；Adal1和Cya均購自Sigma公司；Neurobasal培養(yǎng)基、改良Eagle培養(yǎng)基、胎牛血清均購自GIBCO公司；活細(xì)胞計(jì)數(shù)(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購自日本株式會社同仁化學(xué)研究所；Hoechst 33342熒光染色試劑盒和TUNEL試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 原代皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)及鑒定 取妊娠15～16 d孕鼠1只，頸椎脫臼處死，75%乙醇消毒腹部，打開腹腔，取出胎鼠。解剖顯微鏡下分離并剪碎腦組織，用0.25%胰蛋白酶37 ℃水浴消化10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)終止消化反應(yīng)。離心后徹底洗凈胰酶，加入接種培養(yǎng)基，200目不銹鋼濾器過濾，以2.5×105/cm密度種板。24 h后更換Neurobasal生長培養(yǎng)基，第5天全量換液，于第7天半量換液后用于實(shí)驗(yàn)。用神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，計(jì)數(shù)陽性神經(jīng)元達(dá)95%以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 神經(jīng)元增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)的神經(jīng)元用Rand A 1.0軟件完全隨機(jī)分為正常對照組(Control組)、模型組(OGD組)和OGD+OME組(分別加入3、10、30、100、300 μg/ml的OME)。ALDH2激動劑Adal1和阻滯劑Cya對OGD神經(jīng)元凋亡的影響：將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、OGD組、OGD+Adal1組和OGD+Cya組。ALDH2活性測定：將培養(yǎng)的神經(jīng)元隨機(jī)分為Control組、OGD組和OGD+OME組(10 μg/ml的OME)。

1.2.3 OGD模型的建立 培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元更換正常培養(yǎng)基為無糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為94%氮?dú)狻?%二氧化碳(CO2)的缺氧箱中進(jìn)行OGD處理12 h。然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率在35%～50%即為造模成功。

1.2.4 CCK-8法檢測神經(jīng)元的增殖 取細(xì)胞密度為2×105/ml對數(shù)生長期細(xì)胞，每孔100 μl接種至96孔培養(yǎng)板中，Control組、OGD組及不同濃度OGD+OME組各6復(fù)孔。24 h后OGD+OME組分別加入終濃度為3、10、30、100、300 μg/ml的OME，OGD組加入等體積溶媒，并均進(jìn)行OGD處理12 h。采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力：每孔加入10 μl CCK-8檢測液，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm 波長檢測各孔吸光度值(A450)，重復(fù)3次。以O(shè)D450表示細(xì)胞增殖能力，OD450=實(shí)驗(yàn)組A值/Control組A值×100%。以Control組為標(biāo)準(zhǔn)(即100%)，其他組的OD450值與Control組的OD450值之比即為該組的相對存活率。

1.2.5 Hoechst 33342熒光染色及TUNEL法觀察神經(jīng)元凋亡 收集Control組、OGD組及不同濃度OGD+OME組處理過的細(xì)胞，PBS洗滌1次。加入Hoechst 33342(終濃度10 μg/ml)，常溫下孵育15 min，離心去上清液。然后按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，滴片后于熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)元凋亡 將Control組、OGD組及不同濃度OGD+OME組、OGD+Adal1組、OGD+Cya組培養(yǎng)12 h的神經(jīng)元用胰酶消化、吹打，細(xì)胞懸浮后用胎牛血清終止消化，PBS洗滌2次。收集細(xì)胞，取106/mm3重懸細(xì)胞，按Annexin V/PI染色試劑盒說明書操作后，用流式細(xì)胞儀檢測、分析神經(jīng)元凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 ALDH2活性測定 收集Control組、OGD組和OGD+OME組(10 μg/ml的OME)神經(jīng)元，按照操作說明書提取線粒體蛋白，用二辛可酸法測定蛋白濃度，并用PBS調(diào)整蛋白濃度一致。采用半自動生化分析儀測定ALDH2活性：方法為速率法，波長340 nm，溫度37 ℃，讀數(shù)時間60 s，延遲時間30 s，吸入量450 μl，反應(yīng)方向?yàn)檎较?，因?shù)1 746。因?yàn)锳LDH2活性測定受到很多因素影響，如溫度、濕度等，而且每次測定時即使條件一致，儀器本身也會影響結(jié)果，故每次測定后將Control組ALDH2活性標(biāo)準(zhǔn)化為100%，其他組ALDH2活性再與Control組比較后再相對化，稱為ALDH2相對活性。整個ALDH2活性測定需要重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 OME對OGD神經(jīng)元增殖的影響 與Control組比較，OGD處理12 h后原代神經(jīng)元增殖能力(OD450值)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),相對存活率減少了61.42%；與OGD組比較，10、30 μg/ml OME均能促進(jìn)神經(jīng)元增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，相對存活率提高；但與OGD組比較，100 μg/ml的OME對神經(jīng)元的增殖能力無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而與OGD組比較，300 μg/ml的OME反而使細(xì)胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，相對存活率下降(見表1)。

2.2 OME對OGD神經(jīng)元凋亡的影響 Hoechst 33342熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察到正常神經(jīng)元的細(xì)胞核染成暗藍(lán)色，細(xì)胞核大小、形態(tài)正常；凋亡的神經(jīng)元細(xì)胞核呈亮藍(lán)色、大小不等，核固縮、碎裂甚至可見凋亡小體(如箭頭所示)。TUNEL染色為綠色的即為凋亡細(xì)胞核(如箭頭所示)，與OGD組比較，10、30 μg/ml OME使凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少(見圖1)。

神經(jīng)元增殖實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了OGD+300 μg/ml OME組，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元增殖能力反而下降，可能是藥物濃度太高導(dǎo)致細(xì)胞毒性反應(yīng)，故神經(jīng)元凋亡實(shí)驗(yàn)中不再設(shè)置OGD+300 μg/ml OME組。流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)元凋亡率顯示，與Control組比較，OGD處理12 h后神經(jīng)元凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與OGD組比較，10、30 μg/ml的OME則可使神經(jīng)元凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但與OGD組比較，100 μg/ml的OME對神經(jīng)元凋亡率無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.3 ALDH2激動劑Adal1和阻滯劑Cya對OGD神經(jīng)元凋亡的影響 與Control組比較，OGD處理12 h后，神經(jīng)元凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD組比較，ALDH2激動劑Adal1能降低神經(jīng)元凋亡率，而ALDH2阻滯劑Cya則能增加神經(jīng)元凋亡率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表1 各組神經(jīng)元增殖情況比較

注：OME=奧美拉唑；-表示無數(shù)據(jù)；與Control組比較，*P<0.01；與OGD組比較，△P<0.05，▲P<0.01

注：a/A為Control組，b/B為OGD組，c/C為OGD+OME 3 μg/ml組，d/D為OGD+OME 10 μg/ml組，e/E為OGD+OME 30 μg/ml組，f/F為OGD+OME 100 μg/ml組

圖1 Hoechst 33342和TUNEL檢測OME對神經(jīng)元凋亡的影響

Figure1 The effects of OME on neuron apoptosis by Hoechst 33342 fluorescence staining and TUNEL

表2 各組神經(jīng)元凋亡率比較

注：與Control組比較，*P<0.01；與OGD組比較，△P<0.01，▲P<0.05

表3 Adal1和Cya對神經(jīng)元凋亡率的影響

注：與Control組比較，*P<0.01；與OGD組比較，△P<0.01；與OGD+Adal1組比較，▲P<0.01

2.4 OME對OGD神經(jīng)元ALDH2活性的影響 與Control組比較，OGD組神經(jīng)元ALDH2相對活性降低了74.01%,而10 μg/ml OME使OGD神經(jīng)元ALDH2相對活性增加了130.00%(見圖2)。

圖2 各組神經(jīng)元ALDH2相對活性比較

Figure2 Comparison of the activities of ALDH2 in neuron among different groups

3 討論

腦缺血缺氧后，神經(jīng)元細(xì)胞器結(jié)構(gòu)受損，能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、激發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[7-9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦病早期，缺血中心神經(jīng)元死亡以壞死為主；而其周圍(缺血半暗帶) 的神經(jīng)元仍然具有代謝活性，最終的死亡以凋亡為主[10-12]。由于細(xì)胞凋亡是一個長期、慢性的過程，且具有可預(yù)防性和可逆的，故在缺血早期前用藥抑制神經(jīng)元的凋亡，可有效地保護(hù)半暗帶神經(jīng)元，阻止凋亡的發(fā)展，從而阻止疾病發(fā)展和惡化，使缺血性腦損傷得到有效的治療。因而抑制神經(jīng)元凋亡也是治療缺血性腦卒中的一個重要策略。

OGD模型又稱氧糖剝奪模型，自Goldberg等[13]成功建立了原代培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型后，被廣泛用于研究離體水平腦缺血損傷[14]，這一模型不僅能夠模擬整體水平腦缺血損傷，還是離體水平評價藥物神經(jīng)保護(hù)作用的有效手段。因此本研究也選擇在該模型上進(jìn)行深入探討，結(jié)果顯示原代神經(jīng)元OGD處理后凋亡率增加，顯微鏡下見細(xì)胞大小不等，核固縮、碎裂，甚至可見凋亡小體。說明在低氧低糖的情況下，細(xì)胞凋亡增加，增殖能力下降，細(xì)胞的存活率下降。同時本研究還發(fā)現(xiàn)激動ALDH2，能對抗OGD導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，而阻斷ALDH2，則使神經(jīng)元凋亡更加明顯，說明ALDH2活性與神經(jīng)元凋亡有相關(guān)性。加入OME干預(yù)后，神經(jīng)元凋亡減少，增殖能力和存活率增加，且ALDH2活性增高，這表明OME對OGD致神經(jīng)元的損傷具有一定的保護(hù)作用，這與抗凋亡、增高ALDH2的活性相關(guān)。但在OME濃度過高(300 μg/ml)時，神經(jīng)元增殖能力反而降低，這可能與藥物濃度過高帶來的細(xì)胞損害作用相關(guān)。

ALDH2是存在于線粒體的一種酶，主要功能是參與乙醇的代謝，使乙醇的毒性中間產(chǎn)物乙醛被氧化為無害的乙酸。近年來，許多研究表明ALDH2具有心腦血管保護(hù)作用，ALDH2改變與氧化損傷密切相關(guān)。有研究表明，激活A(yù)LDH2會降低缺血性損傷所致的心肌損害，其機(jī)制與ALDH2協(xié)同調(diào)節(jié)心肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)內(nèi)源性保護(hù)信號有關(guān)[15-16]；對于缺血性腦損傷，ALDH2與腦內(nèi)蛋白激酶Cε(PKCε)直接相互結(jié)合，PKCε可以調(diào)節(jié)ALDH2的激活，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[6]。ALDH2過表達(dá)小鼠的心肌梗死及腦梗死面積較野生型小鼠顯著減小；反之，ALDH2敲除小鼠的心肌梗死面積及腦梗死面積較野生型小鼠顯著增加。因此，增強(qiáng)ALDH2活性可能為腦缺血的防治提供新的方向。

OME是全球公認(rèn)的治療消化性潰瘍及反流性食管炎等酸相關(guān)性疾病的質(zhì)子泵抑制劑，臨床也利用其對胃黏膜保護(hù)作用而用于急性酒精中毒的治療。本課題組前期實(shí)驗(yàn)偶然發(fā)現(xiàn)OME可以提高肝臟線粒體ALDH2活性，考慮OME對血-腦脊液屏障穿透性差，故選擇在離體神經(jīng)元上研究，發(fā)現(xiàn)OME亦能提高神經(jīng)元線粒體內(nèi)ALDH2活性，從而促進(jìn)神經(jīng)元增殖，抑制神經(jīng)元凋亡。這也許會給OME的應(yīng)用帶來新的機(jī)遇，但還需要對此進(jìn)一步探討。

1 Jauch EC，Cucchiara B，Adeoye O，et al.Part 11：adult stroke：2010 American Heart Association Guidelines for Cardiopulmonary Resuscitation and Emergency Cardiovascular Care[J].Circulation，2010，122(18 Suppl 3)：S818-828.

2 Feigin VL，Lawes CMM，Bennett DA，et al.Worldwide stroke incidence and early case fatality reported in 56 population-based studies：a systematic review[J].Lancet Neurol，2009，8(4)：355-369.

3 World Health Organization.World Health Statistics 2008[R].Geneva：World Health Organization，2008.

4 Strong K，Mathers C，Bonita R.Preventing stroke：saving lives around the world[J].Lancet Neurol，2007，6(2)：182-187.

5 Chen CH，Budas GR，Churchill EN，et al.Activation of aldehyde dehydrogenase-2 reduces ischemic damage to the heart[J].Science，2008，321(5895)：1493-1495.

6 Guo JM，Liu AJ，Zang P，et al.ALDH2 protects against stroke by clearing 4-HNE[J].Cell Res，2013，23(7)：915-930.

7 Mdzinarishvili A，Sumbria R，Lang D，et al.Ginkgo extract EGb761 confers neuroprotection by reduction of glutamate release in ischemic brain[J].J Pharm Pharm Sci，2012，15(1)：94-102.

8 Yang M，Wang S，Hao F，et al.NMR analysis of the rat neurochemical changes induced by middle cerebral artery occlusion[J].Talanta，2012，88：136-144.

9 Sutherland BA，Minnerup J，Balami JS，et al.Neuroprotection for ischaemic stroke：translation from the bench to the bedside[J].Int J Stroke，2012，7(5)：407-418.

10 Nakajima W，Ishida A，Lange MS，et al.Apoptosis has a prolonged role in the neurodegeneration after hypoxic ischemia in the newborn rat[J].J Neurosci，2000，20(21)：7994-8004.

11 Mansouri B，Henne WM，Oomman SK，et al.Involvement of calpain in AMPA-induced toxicity to rat cerebellar Purkinje neurons[J].Eur J Pharmacol，2007，557(2/3)：106-114.

12 Ekshyyan O，Aw TY.Apoptosis：a key in neurodegenerative disorders[J].Curr Neurovasc Res，2004，1(4)：355-371.

13 Goldberg MP，Strasser U，Dugan LL.Techniques for assessing neuroprotective drugs in vitro[J].Int Rev Neurobiol，1997，40：69-93.

14 Goldberg MP，Choi DW.Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture：calcium-dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal injury[J].J Neurosci，1993，13(8)：3510-3524.

15 Ma H，Li J，Gao F，et al.Aldehyde dehydrogenase 2 ameliorates acute cardiac toxicity of ethanol：role of protein phosphatase and forkhead transcription factor[J].J Am Coll Cardiol，2009，54(23)：2187-2196.

16 Ma H，Yu L，Byra EA，et al.Aldehyde dehydrogenase 2 knockout accentuates ethanol-induced cardiac depression：role of protein phosphatases[J].J Mol Cell Cardiol，2010，49(2)：322-329.

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乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase)(EC1.2.1.10)(CAS[9028-91-5])是醛脫氫酶的一種，負(fù)責(zé)催化乙醛氧化為乙酸的反應(yīng)。肝中的乙醇脫氫酶負(fù)責(zé)將乙醇氧化為乙醛，生成的乙醛作為底物進(jìn)一步在乙醛脫氫酶催化下轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的乙酸(醋的成分)。乙醛毒性高于乙醇，是造成宿醉的主要原因之一。而且乙醛被懷疑具有致癌性，與人類腫瘤的發(fā)生存在一定的關(guān)系。負(fù)責(zé)人體內(nèi)乙醛轉(zhuǎn)化的主要是肝中的乙醛脫氫酶，乙醛脫氫酶1與乙醛脫氫酶2在催化速率上有很明顯的差異。