李樹海 田輝 岳韋名 李林 高存 司立博 胡文思 亓磊 魯銘 崔京京 陳觀卿

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer，ESCC)是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。由于疾病進展、局部復發(fā)、遠處轉移、化療抵抗等因素，ESCC患者的總體5年生存率仍未得到根本性提高，為10%～40%[2-3]。臨床上，患者預后判定和治療策略的制定主要是根據(jù)疾病的病理分期，但即使術后處于同一病理分期的患者，其預后也往往存在著較明顯的差異，因此，僅僅依據(jù)病理分期來預測患者的預后并制定相應治療措施的針對性較差[4-5]。隨著腫瘤分子生物學研究的不斷進展，ESCC的分子預后研究愈加受到重視，發(fā)現(xiàn)能夠有效預測ESCC進展及患者預后的新分子標志物，結合傳統(tǒng)病理分期對術后高?；颊哌M行篩選，優(yōu)化ESCC患者的個體化治療，是ESCC治療的方向之一[6]。

MicroRNA(miRNA)近年來成為生命科學研究領域中的明星分子，是僅有19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA[7-9]。已有的研究表明：異常表達的miRNA廣泛參與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移及耐藥等演進過程[10-12]。miR-148a作為miRNA家族中的一員，是一種高度保守的miRNA，其前體序列定位于人類7號染色體短臂的1區(qū)5帶[13]。miR-148a主要發(fā)揮抑癌基因樣作用，抑制惡性腫瘤細胞的遷移、侵襲并促進細胞凋亡，從而逆轉腫瘤細胞的惡性表型，越來越受到研究者的重視[14-17]。miR-148a在人類多種惡性腫瘤組織中表達降低，然而，有關ESCC組織中miR-148a的表達及其與患者臨床病理指標及預后的相關性，目前國內(nèi)尚未見相關的研究報道。

本研究采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測ESCC組織中miR-148a的表達水平，并結合患者的臨床病理資料和術后隨訪資料進行相關的統(tǒng)計分析，研究miR-148a表達與患者臨床病理指標及預后的相關性，探討miR-148a在ESCC進展及預后判定中的作用和臨床意義。

資料與方法

一、 臨床資料

本研究選取2009年1至12月在山東大學齊魯醫(yī)院胸外科行食管癌手術治療的患者，患者納入標準：(1)行食管癌切除、胃食管吻合及系統(tǒng)性淋巴結清掃術[18]；(2)術前的相關輔助檢查未發(fā)現(xiàn)遠處轉移病灶；(3)臨床病理資料及隨訪資料均完整；(4)術前未接受放療或化療?；颊吲懦龢藴剩孩傩g前行放療或化療；②隨訪資料不完整；③圍手術期死亡；④行姑息性切除。共有75例患者符合上述納入標準，其中男性56例，女性19例；年齡39～75歲。

ESCC的診斷標準參照世界衛(wèi)生組織2000年的消化道腫瘤組織學分類標準[19]，術后病理分期參照國際抗癌聯(lián)盟2002年的TNM分期標準[20]。

二、 Real-time PCR法檢測miR-148a的表達

在八聯(lián)管中配制以下反應體系(20 μl)：模板cDNA 2 μl、SYBR Green反應液10 μl、去離子水6 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl。使用ABI7500 PCR反應儀進行反應，測定miRNA的表達。miR-148a表達水平的檢測以U6作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt方法計算miR-148a的相對表達量。相對表達量高于測定的平均值定義為miR-148a高表達；相對表達量低于測定的平均值定義為miR-148a低表達。

三、 隨訪

所有患者均順利出院，每隔3～6個月隨訪1次。隨訪內(nèi)容包括體格檢查、鋇餐、化驗分析、CT、超聲以及必要時行胃鏡檢查等。記錄從手術之日起至患者死亡或隨訪截止日的時間，計算總生存率。本研究的隨訪截止時間為2012年12月，中位隨訪時間為38個月(8～47個月)。

四、 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，將患者的臨床病理資料、隨訪資料及實驗數(shù)據(jù)共同建立數(shù)據(jù)庫。χ2檢驗比較miR-148a表達與患者臨床病理指標之間的關系；Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線；Log-rank檢驗比較患者的生存差別；Cox多因素回歸分析判定獨立的預后因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、 miR-148a表達與患者臨床病理指標間的關系

42.7%(32/75)的患者腫瘤組織中檢測到miR-148a低表達，χ2檢驗結果顯示miR-148a低表達與腫瘤的浸潤深度(T120.0%、T228.0%、T357.5%，χ2=8.149，P=0.017)、淋巴結轉移(N030.6%、N153.8%，χ2=4.151，P=0.042)和病理分期(Ⅰ期22.2%、Ⅱ期34.2%、Ⅲ期60.7%，χ2=6.474，P=0.039)顯著相關，而與患者的性別(χ2=0.230，P=0.632)、年齡(χ2=0.020，P=0.888)、腫瘤直徑(χ2=0.523，P=0.770)及腫瘤分化程度(χ2=0.461，P=0.794)均無顯著的相關性(表1)。

二、 單因素和多因素生存分析

75例患者術后3年的總生存率為70.7%(53/75)。單因素生存分析結果顯示：腫瘤浸潤深度(T1100.0%、T292.0%和T350.0%，χ2=18.288，P<0.001)、淋巴結轉移(N091.7%和N151.3%，χ2=14.285，P<0.001)及miR-148a低表達(低表達53.1%和高表達83.7%，χ2=9.136，P=0.003)(圖1)均與患者的不良預后顯著相關。Cox多因素回歸分析結果顯示：浸潤深度(95%CI為1.015～2.799，P=0.044)和淋巴結轉移(95%CI為1.285～4.796，P=0.007)分別是判定患者術后3年總生存率的獨立預后因素(表2)。

討 論

miR-148a作為一種重要的抑癌基因，通過對靶基因的調(diào)控來抑制惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及耐藥等多種惡性表型，它在人類多種惡性腫瘤(結直腸癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等)中的表達水平是下降的，并與腫瘤進展及患者不良預后密切相關，已成為研究的熱點分子之一，有可能成為指導惡性腫瘤患者臨床個體化治療及預后判定的一個有效標志物[13,17,21-26]。本研究首次檢測了ESCC組織中miR-148a的表達水平，并探討其與患者臨床病理指標及預后的相關性。

本研究結果顯示：miR-148a在ESCC組織中存在異常低表達，并與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移及病理分期顯著相關，提示miR-148a可能在ESCC的進展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。miR-148a表達的降低使ESCC細胞獲得更具侵襲性的表型，促進ESCC的侵襲和進展，miR-148a有可能成為潛在的抗ESCC進展治療的新靶點。然而，惡性腫瘤的侵襲轉移是一個極其復雜的動態(tài)過程，涉及多種基因、細胞，并受多因子不同層次的調(diào)控，miR-148a調(diào)控ESCC進展的具體機制還需在分子水平上進行更加深入的研究和探討。

生存分析結果顯示，miR-148a低表達患者的術后3年總生存率顯著低于miR-148a高表達患者，表明miR-148a有可能成為ESCC患者術后預后判定的潛在預測指標。然而，Cox回歸多因素分析的結果卻顯示腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移分別是判定患者術后3年總生存率的獨立預后因素。本研究中可能由于納入的患者例數(shù)太少、隨訪時間過短及術后不同的輔助治療方案等，存在一定的偏倚，導致miR-148a在ESCC預后判定中的價值未得到客觀及充分的體現(xiàn)。

總之，本研究首次探討了ESCC組織中miR-148a表達與患者臨床病理指標及預后之間的相關性，結果表明miR-148a在ESCC組織中存在異常低表達，并與腫瘤進展及患者不良預后密切相關，提示miR-148a不僅可以作為一個判定ESCC進展及患者預后的潛在參考指標，并且有可能成為一個有效的抗ESCC治療的新靶點。

表2 食管癌患者術后單因素和多因素生存分析

1Sano A, Kato H, Sakurai S, et al. CD24 expression is a novel prognostic factor in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Ann Surg Oncol, 2009,16(2):506-514.

2Ren Y, Cao B, Law S, et al. Hepatocyte growth factor promotes cancer cell migration and angiogenic factors expression: a prognostic marker of human esophageal squamous cell carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(17):6190-6197.

3Mariette C, Balon JM, Piessen G, et al. Pattern of recurrence following complete resection of esophageal carcinoma and factors predictive of recurrent disease[J]. Cancer, 2003,97(7):1616-1623.

4Law S, Kwong DL, Kwok KF, et al. Improvement in treatment results and long-term survival of patients with esophageal cancer: impact of chemoradiation and change in treatment strategy[J]. Ann Surg, 2003,238(3):339-347.

5Okawa T, Naomoto Y, Nobuhisa T, et al. Heparanase is involved in angiogenesis in esophageal cancer through induction of cyclooxygenase-2[J]. Clin Cancer Res, 2005;11(22):7995-8005.

6Shih CH, Ozawa S, Ando N, et al. Vascular endothelial growth factor expression predicts outcome and lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the esophagus[J]. Clin Cancer Res, 2000;6(3):1161-1168.

7Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004,116(2):281-297.

8Lim LP, Lau NC, Garrett-Engele P, et al. Microarray analysis shows that some microRNAs down regulate large numbers of target mRNAs[J]. Nature, 2005,433(7027):769-773.

9Dykxhoorn DM. MicroRNAs and metastasis: little RNAs go a long way[J]. Cancer Res, 2010,70(16):6401-6406.

10 Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers[J]. Nat Rev Cancer, 2006,6(11):857-866.

11 Lovat F, Valeri N, Croce CM. Micro-RNAs in the pathogenesis of cancer[J]. Semin Oncol, 2011,38(6):724-733.

12 Chen PS, Su JL, Hung MC. Dysregulation of microRNAs in cancer[J]. J Biomed Sci, 2012,19:90.

13 賈筱琴,繆俊俊,雍軍,等.miR-148a對肝癌細胞株侵襲和遷移的抑制作用及機制[J].中國癌癥雜志,2014,24(6):412-417.

14 Chen Y, Song Y, Wang Z, et al. Altered expression of MiR-148a and MiR-152 in gastrointestinal cancers and its clinical significance[J]. J Gastrointest Surg, 2010,14(7):1170-1179.

15 Hummel R, Watson DI, Smith C, et al. Mir-148a improves response to chemotherapy in sensitive and resis-tant oesophageal adenocarcinoma and squamous cell carcinoma cells[J]. J Gastrointest Surg, 2011,15(3):429-438.

16 Zhang H, Li Y, Huang Q, et al. MiR-148a promotes apoptosis by targeting Bcl-2 in colorectal cancer[J]. Cell Death Differ, 2011,18(11):1702-1710.

17 Takahashi M, Cuatrecasas M, Balaguer F, et al. The clinical significance of MiR-148a as a predictive biomarker in patients with advanced colorectal cancer[J]. PLoS One, 2012,7(10):e46684.

18 Korst RJ, Rusch VW, Venkatraman E, et al. Proposed revision of the staging classification for esophageal cancer[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1998;115(3):660- 669.

19 Hamilton SR, Aaltonen LA. Tumours of the digestive system[M]//Pathology and Genetics, World Health Organization Classification of Tumours. Lyon :IARC Press, 2000:10-25.

20 Greene FL, Page DL, Fleming ID, et al. AJCC cancer staging handbook[M]. 6th ed. New York: Springer-Verlag, 2002:91-98.

21 Fujita Y, Kojima K, Ohhashi R, et al. MiR-148a attenuates paclitaxel resistance of hormone-refractory, drug-resistant prostate cancer PC3 cells by regulating MSK1 expression[J]. J Biol Chem, 2010,285(25):19076-19084.

22 Murata T, Takayama K, Katayama S, et al. miR-148a is an androgen-responsive microRNA that promotes LNCaP prostate cell growth by repressing its target CAND1 expression[J]. Prostate Cancer Prostatic Dis, 2010,13(4):356-361.

23 邱光庭,王遂函,李大鵬,等.微小RNA-148a對胃癌細胞MKN45增殖能力的影響及機制研究[J].中華胃腸外科雜志,2014,17(10):1036-1039.

24 Bofill-De Ros X, Gironella M, Fillat C. miR-148a- and miR-216a-regulated oncolytic adenoviruses targeting pancreatic tumors attenuate tissue damage without perturbation of miRNA activity[J]. Mol Ther, 2014,22(9):1665-1677.

25 Tao S, He H, Chen Q, et al. GPER mediated estradiol reduces miR-148a to promote HLA-G expression in breast cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014,451(1):74-78.

26 Zhou X, Zhao F, Wang ZN, et al. Altered expression of miR-152 and miR-148a in ovarian cancer is related to cell proliferation[J]. Oncol Rep, 2012,27(2):447-454.