華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院//教育部環(huán)境理論化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

雙酚A和壬基酚對(duì)河蜆呼吸代謝和抗氧化酶活性的影響

曾麗璇，張悅君，康 園，張秋云

華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院//教育部環(huán)境理論化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

為了研究雙酚A(Bisphenol A，BPA)和壬基酚(Nonylphenol，NP)對(duì)河蜆(Corbicula fluminea) 呼吸代謝能力和抗氧化酶活性的影響，探討B(tài)PA和NP對(duì)河蜆的毒性作用。以河蜆為受試生物，采用半靜態(tài)染毒法，研究了BPA和NP對(duì)河蜆的單一毒性等級(jí)、聯(lián)合毒性作用類(lèi)型和對(duì)河蜆耗氧率、排氨率以及抗氧化酶系統(tǒng)中SOD、CAT活性的影響。結(jié)果顯示：① BPA、NP對(duì)河蜆的半致死質(zhì)量濃度(96 h-LC50)分別為6.34和1.09 mg·L-1，毒性順序?yàn)镹P＞BPA，二者均為高毒物質(zhì)；② BPA-NP對(duì)河蜆毒性作用類(lèi)型為協(xié)同作用；③亞急性毒性指標(biāo)耗氧率、排氨率以及超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)對(duì)BPA、NP及二者混合物均比較敏感，在本試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(BPA：0.63、0.79、1.59、3.17 mg·L-1；NP：0.109、0.136、0.271、0.542 mg·L-1；BPA+NP：(0.078 2+0.029)、(0.097 8+0.036 3)、(0.196+0.072 5)、(0.391+0.145) mg·L-1)，河蜆耗氧率、排氨率以及兩種酶活性變化均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，其中在BPA、NP和二者混合物的質(zhì)量濃度較低時(shí)，河蜆的耗氧率和排氨率、SOD和CAT活性只有微小降低，隨著質(zhì)量濃度的升高，河蜆耗氧率和排氨率、兩個(gè)酶活性相對(duì)均有所升高，而在質(zhì)量濃度極高時(shí)其耗氧率和排氨率以及兩個(gè)酶活性才又受到顯著性或極顯著性的抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示河蜆耗氧率、排氨率和SOD、CAT活性對(duì)水體中酚類(lèi)內(nèi)分泌干擾物反應(yīng)敏感，具有較好的一致性和規(guī)律性，耗氧率、排氨率和SOD、CAT活性與其他敏感性指標(biāo)一起可以作為酚類(lèi)內(nèi)分泌干擾物污染的一項(xiàng)早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

雙酚A；壬基酚；河蜆；耗氧率；排氨率；SOD；CAT

酚類(lèi)內(nèi)分泌干擾物(Phenolic endocrine disrupting chemicals，pEDCs)是內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals，EDCs)中，具有1-2個(gè)苯酚基團(tuán)、苯環(huán)上結(jié)合了不同化學(xué)結(jié)構(gòu)取代基的化合物。其中的壬基酚(Nonylphenol，NP)和雙酚A(Bisphenol A，BPA)因在環(huán)境中廣泛存在而備受關(guān)注(牛海崗等，2009；Vandenberg等，2007)。

BPA、NP在環(huán)境中一般共存于水體、土壤和食品中(NASU等，2001；LAGAN等，2004；ZHANG等，2011)，通過(guò)接觸進(jìn)入機(jī)體。目前關(guān)于BPA、NP對(duì)魚(yú)類(lèi)、水蚤和海洋貝類(lèi)等水生動(dòng)物毒性效應(yīng)的研究較多，但均為單一染毒的資料(Canesi等，2007；Segner等，2003；莊惠生和楊光，2005；Hasselberg等，2004；LI，2008)，關(guān)于二者混合對(duì)雙殼貝類(lèi)的毒性研究相對(duì)較少。

河蜆(Corbicula fluminea) 原產(chǎn)我國(guó)，是一種主要棲息于淡水及咸淡水的江河、湖泊及入海口中常見(jiàn)的雙殼貝類(lèi)，現(xiàn)已廣泛分布于世界各地的水域中，主要以水中的浮游生物(如硅藻、綠藻、原生動(dòng)物、輪蟲(chóng)等)為食料(Way等，1990)。已有報(bào)道用河蜆作為指示生物進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)等的研究( Marie等，2006；Vidal等，2001)。

動(dòng)物耗氧率(Oxygen Consumption Rate，OCR)和排氨率(Ammonia Excretory Rate，AER)的大小及變化能夠反映其呼吸代謝能力的高低及變化規(guī)律，因而常作為衡量動(dòng)物能量消耗的一個(gè)指標(biāo)，可以作為反映某些污染物毒性大小的敏感指標(biāo)(Cheung和Cheung，1995)。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)是生物體內(nèi)廣泛存在的2個(gè)重要的抗氧化防御系統(tǒng)酶，它們的活性可作為生物逆境生理和衰老生理指標(biāo)(Wang等，1989)。

為真實(shí)反映BPA和NP在環(huán)境中共存對(duì)雙殼貝類(lèi)可能造成的毒性作用，本研究應(yīng)用同批河蜆在同等條件下同時(shí)進(jìn)行了BPA、NP單一染毒和混合染毒試驗(yàn)，并通過(guò)不同質(zhì)量濃度的BPA、NP和二者混合物對(duì)河蜆抗氧化酶SOD和CAT活性，以及耗氧率和排氨率的大小的變化，來(lái)探明BPA、NP及二者混合物對(duì)河蜆抗氧化酶系統(tǒng)和呼吸代謝能力的毒性影響，以期為酚類(lèi)內(nèi)分泌干擾物水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制定和建立早期生態(tài)預(yù)警體系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：BSA1245S-CW電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；UV-3100PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；玻璃勻漿器。

試劑：雙酚A(國(guó)產(chǎn)分析純)；壬基酚(國(guó)產(chǎn)分析純)；乙醇(國(guó)產(chǎn)分析純)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用河蜆來(lái)自珠江三角洲河網(wǎng)中水質(zhì)較好的增江。選取殼長(zhǎng)(25.0±2.0) mm，殼高(19.40±0.20) mm，體質(zhì)量為(4.00±0.40) g 的健康河蜆用于試驗(yàn)。河蜆用經(jīng)過(guò)3 d自然脫氯和已充分曝氣的自來(lái)水在試驗(yàn)室暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)期間水溫為(20±1) ℃，自然光照。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 急性毒性試驗(yàn)

急性毒性采用半靜態(tài)換水式試驗(yàn)，每24 h更換1次試驗(yàn)液，換水后加入BPA至初始質(zhì)量濃度。試驗(yàn)容器為定制的容積為1 L的玻璃水族箱，每升水中放10只河蜆，試驗(yàn)期間不喂食，試驗(yàn)條件控制在水溫(20±1) ℃，pH值為7.5～8.0，溶解氧為7～8 mg·L-1。預(yù)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)間隔較大的質(zhì)量濃度梯度，每組設(shè)3個(gè)平行，求出48 h的100%死亡、無(wú)死亡和大致半致死質(zhì)量濃度。正式試驗(yàn)按照預(yù)試驗(yàn)所得結(jié)果設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度試驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組、1個(gè)溶劑對(duì)照組(φ=0.1%的乙醇)，每組設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)期間連續(xù)觀察受試對(duì)象的活動(dòng)情況，及時(shí)清除死亡的河蜆和代謝物，每隔24 h記錄河蜆的死亡情況。判斷個(gè)體死亡的標(biāo)準(zhǔn)：河蜆外膜收縮、刺激時(shí)腹足不能收縮、雙殼張開(kāi)，多次用鑷子適度敲擊殼體，并夾緊雙殼而沒(méi)有自動(dòng)閉殼反應(yīng)作為死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)。暴露96 h后計(jì)算其半致死質(zhì)量濃度(Median lethal concentration, LC50)。然后按下式計(jì)算安全質(zhì)量濃度(SC): SC = 96 h-LC50×0.01。

1.3.2 聯(lián)合急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BPA和NP對(duì)河蜆的96 h-LC50分別為6.34 mg·L-1和1.09 mg·L-1。聯(lián)合毒性作用類(lèi)型采用等效應(yīng)曲線法進(jìn)行評(píng)價(jià)，將BPA和NP的96 h-LC50數(shù)值比為1:1時(shí)定義為一個(gè)毒性單位，分別配置0.25、0.50、0.75和1.00個(gè)毒性單位的混合染毒液，不同毒性單位的混合染毒液按照下式進(jìn)行配置：

X毒性單位的混合染毒液=X(LC50-A+LC50-B)

A、B代表對(duì)河蜆進(jìn)行聯(lián)合毒性試驗(yàn)的2種污染物，X代表試驗(yàn)中所使用的混合液配比，X為0.25、0.50、0.75和1.00。

1.3.3 亞急性毒性試驗(yàn)

亞急性毒性試驗(yàn)以單一污染物和2種污染物混合液96 h-LC50的1/10、1/8、1/4和1/2設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度組，另設(shè)1個(gè)溶劑對(duì)照組(φ=0.1%的乙醇)，每組設(shè)3個(gè)平行，對(duì)河蜆進(jìn)行為期7 d的亞急性染毒試驗(yàn)，試驗(yàn)采用半靜態(tài)換水，暴露期間的實(shí)驗(yàn)方法與96h–LC50急性毒性試驗(yàn)相同，每天觀察記錄河蜆的死亡情況，并及時(shí)清除死亡的河蜆和代謝物。

1.3.4 耗氧率和排氨率的測(cè)定

耗氧率和排氨率的測(cè)定采用劉其根等( 1999)的方法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)試驗(yàn)前后代謝瓶?jī)?nèi)水中的溶解氧及氨氮含量，按下列公式計(jì)算河蜆的耗氧率和排氨率：

式中：OR為單位體質(zhì)量耗氧率，mg·g-1·h-1；DO0和DOt為試驗(yàn)開(kāi)始、在t時(shí)間結(jié)束時(shí)水中DO的含量，mg·L-1；V為代謝瓶中水的體積，L；W為河蜆質(zhì)量，g；t為試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間，h。

式中：NR為單位河蜆個(gè)體質(zhì)量排氨率，mg·g-1·h-1；N0和Nt為試驗(yàn)開(kāi)始、在t時(shí)間結(jié)束時(shí)水中NH3-N的質(zhì)量濃度，mg·L-1；V為代謝瓶中水的體積，L；W為河蜆質(zhì)量，g；t為試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間，h。

1.3.5 酶活性的測(cè)定

亞急性毒性試驗(yàn)結(jié)束后，從各組中各取出數(shù)只河蜆盡快剖開(kāi)，用濾紙對(duì)其吸干后，稱(chēng)取軟體組織0.50 g用6.7×10-3mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0) 3.0 mL進(jìn)行勻漿，勻漿液倒入離心管中，加3 mL磷酸鹽緩沖溶液沖洗勻漿器后，也倒入離心管中，在4000 r·min-1離心30 min，取上清液為粗酶液。

1）SOD活性的測(cè)定

SOD活力測(cè)定采用鄒國(guó)林等(1986)改進(jìn)的鄰苯三酚自氧化法，波長(zhǎng)λ=325 nm，酶活性單位定義為:每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。

2）CAT活性的測(cè)定

CAT活性測(cè)定采用徐鏡波和袁曉凡(1997)的紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定，波長(zhǎng)λ=240 nm，酶活性定義為：一個(gè)過(guò)氧化酶單位相當(dāng)于在規(guī)定條件下，于25 ℃、pH=7.0，每分鐘分解1 μmol過(guò)氧化氫所需的酶量。

3）總蛋白含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford (1976)的方法，即考馬斯亮藍(lán)法。10.00 mL Bradford染色液加入0.30 mL待測(cè)蛋白，混勻后在595 nm處檢測(cè)吸光度。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以3次平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示；組間數(shù)據(jù)利用單因素方差分析(One-Way AVONA)和Duncan檢驗(yàn)法在P=0.05的置信水平進(jìn)行差異性分析；試驗(yàn)所得結(jié)果用Origin8.0繪圖。

2 結(jié)果

2.1 單一急性毒性試驗(yàn)

單一急性毒性試驗(yàn)結(jié)束后，空白對(duì)照組以及溶劑對(duì)照組均無(wú)死亡。觀察發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)期間未死亡個(gè)體的活動(dòng)能力下降，用鑷子適度敲擊河蜆殼體時(shí)，其閉殼速度緩慢，用玻璃棒刺激河蜆的腹足時(shí)，其收縮速度緩慢，而且其外套膜邊緣有黏性絮狀物包被。BPA、NP對(duì)河蜆的急性毒性結(jié)果見(jiàn)表1。

在同一質(zhì)量濃度試驗(yàn)組中，試驗(yàn)時(shí)間與河蜆的死亡率呈正相關(guān)關(guān)系，即隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)河蜆?biāo)劳雎示尸F(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)。根據(jù)表1的試驗(yàn)結(jié)果，可得到BPA對(duì)河蜆的96 h-LC50為6.34 mg·L-1，其安全質(zhì)量濃度為0.063 mg·L-1；NP對(duì)河蜆的96 h-LC50為1.09 mg·L-1，其安全質(zhì)量濃度為0.0109 mg·L-1。以單一化合物96 h-LC50(mg·L-1) 為毒性大小評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，2種酚類(lèi)有機(jī)物的毒性大小順序?yàn)椋篘P＞BPA。

2.2 聯(lián)合急性毒性試驗(yàn)

BPA和NP對(duì)河蜆的聯(lián)合急性毒性結(jié)果見(jiàn)表2，BPA和NP的聯(lián)合毒性作用等效應(yīng)曲線見(jiàn)圖2。

由圖1可知BPA-NP對(duì)河蜆聯(lián)合作用的96 h-LC50落于95%置信區(qū)間下限線下側(cè)，故BPA-NP對(duì)河蜆聯(lián)合作用的類(lèi)型為協(xié)同作用。

表1 BPA、NP對(duì)河蜆96 h的半致死質(zhì)量濃度Table1 96 h–LC50values of BPA and NP to Asian clam

表2 BPA-NP對(duì)河蜆96h的半致死質(zhì)量濃度Table2 96 h–LC50values of BPA-NP to Asian clam

2.3 亞急性毒性試驗(yàn)

亞急性毒性試驗(yàn)以BPA、NP和2種污染物混合液96 h-LC50的1/10、1/8、1/4和1/2設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度組，即0.63、0.79、1.59、3.17 mg·L-1和0.109、0.136、0.271、0.542 mg·L-1以及(0.0782+0.029)、(0.0978+0.0363)、(0.196+0.0725)、(0.391+0.145) mg·L-1，7 d的亞急性毒性試驗(yàn)結(jié)束后，溶劑對(duì)照組均無(wú)死亡，其他質(zhì)量濃度組死亡率均低于5%。

圖1 BPA-NP聯(lián)合毒性作用等效應(yīng)曲線Fig.1 The joint toxic effect of equivalent curve for BPA-NP

2.3.1 BPA、NP及二者混合物對(duì)河蜆SOD活性的影響

BPA、NP及二者混合物對(duì)河蜆SOD活性的影響結(jié)果顯示(圖2)：在BPA、NP單一污染和混合污染暴露下，河蜆軟體組織SOD活性均表現(xiàn)為隨著污染物質(zhì)量濃度的升高SOD活性先降低后升高再降低。在質(zhì)量濃度為1/10 LC50時(shí)，BPA、NP單一脅迫的SOD活性均接近對(duì)照組水平，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但此時(shí)混合物脅迫的SOD活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/8 LC50時(shí)，BPA、NP單一脅迫的SOD活性均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，而此時(shí)混合物脅迫的SOD活性極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；在質(zhì)量濃度為1/4 LC50時(shí)，BPA單一脅迫的SOD活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，NP單一脅迫的SOD活性接近對(duì)照組水平，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但此時(shí)混合物脅迫的SOD活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/2 LC50時(shí)，BPA、NP單一脅迫的SOD活性均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，但此時(shí)混合物脅迫的SOD活性極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。

圖2 BPA和NP對(duì)河蜆SOD活性的影響Fig.2 Effects of BPA and NP on SOD activities of clams

圖3 BPA和NP對(duì)河蜆CAT活性的影響Fig. 3 Effects of BPA and NP on CAT activities of clams

圖4 BPA和NP對(duì)河蜆耗氧率的影響Fig.4 Effects of BPA and NP on OCR of clams

圖5 BPA和NP對(duì)河蜆排氨率的影響Fig.5 Effects of BPA and NP on AER of clams

2.3.2 BPA、NP及二者混合物對(duì)河蜆CAT活性的影響

BPA、NP及二者混合物對(duì)河蜆CAT活性的影響結(jié)果顯示(圖3)：在BPA、NP單一污染和混合污染暴露下，總體趨勢(shì)均為隨著污染物質(zhì)量濃度的升高CAT活性先降低后升高再降低，各質(zhì)量濃度組中CAT活性均低于對(duì)照組。在質(zhì)量濃度為1/10 LC50時(shí)，BPA、NP單一脅迫的CAT活性均低于對(duì)照組，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但此時(shí)混合物脅迫的CAT活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/8 LC50時(shí)，BPA、NP單一脅迫的CAT活性均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，而此時(shí)混合物脅迫的CAT活性極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；在質(zhì)量濃度為1/4 LC50時(shí)， BPA、NP單一脅迫的CAT活性均低于對(duì)照組，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，而此時(shí)混合物脅迫的CAT活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/2 LC50時(shí)，BPA、NP單一脅迫的CAT活性均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，但此時(shí)混合物脅迫的CAT活性極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。

2.3.3 BPA、NP及二者混合物對(duì)河蜆耗氧率的影響

BPA、NP及二者混合物對(duì)河蜆耗氧率的影響結(jié)果顯示(圖4)：在BPA、NP單一污染和混合污染暴露下，總體趨勢(shì)為隨著污染物質(zhì)量濃度的升高耗氧率先降低后升高再降低，各質(zhì)量濃度組中耗氧率均低于對(duì)照組。在質(zhì)量濃度為1/10 LC50時(shí)，BPA、NP單一脅迫和混合物脅迫的耗氧率均接近對(duì)照組水平，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)；在質(zhì)量濃度為1/8 LC50時(shí)，BPA、NP單一脅迫和混合物脅迫的耗氧率均極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；在質(zhì)量濃度為1/4 LC50時(shí)，BPA單一脅迫和混合物脅迫的耗氧率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，NP單一脅迫的耗氧率極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；在質(zhì)量濃度為1/2 LC50時(shí)，BPA、NP單一脅迫和混合物脅迫的耗氧率均極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。

2.3.4 BPA、NP及二者混合物對(duì)河蜆排氨率的影響

BPA、NP及二者混合物對(duì)河蜆排氨率的影響結(jié)果顯示(圖5)：在BPA、NP單一污染和混合污染暴露下，總體趨勢(shì)為隨著污染物質(zhì)量濃度的升高排氨率先降低后升高再降低，各質(zhì)量濃度組中排氨率均低于對(duì)照組。在質(zhì)量濃度為1/10 LC50時(shí)，BPA的排氨率接近對(duì)照組水平，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，NP單一脅迫和混合物脅迫則顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/8 LC50時(shí)，BPA、NP單一脅迫和混合物脅迫的排氨率均極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；在質(zhì)量濃度為1/4 LC50時(shí)，BPA、NP單一脅迫和混合物脅迫的排氨率均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/2 LC50時(shí)，BPA單一脅迫和混合物脅迫的排氨率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，NP單一脅迫的排氨率極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。

3 討論

3.1 BPA、NP對(duì)河蜆的96 h-LC50

BPA對(duì)河蜆的96 h-LC50為6.34 mg·L-1；NP對(duì)河蜆的96 h-LC50為1.09 mg·L-1，Pascoe等 (2002)報(bào)道了BPA對(duì)水螅96 h-LC50為6.9 mg·L-1；郭匿春和謝平(2009)報(bào)道了BPA對(duì)隆線溞和微型裸腹?溞48 h-LC50分別為11.64、9.63 mg·L-1，NP對(duì)隆線溞和微型裸腹溞48 h-LC50分別為0.159、0.126 mg·L-1。由此可知受試生物不同，相同污染物對(duì)水生生物的LC50不同；不同污染物對(duì)同種水生生物的LC50也不同，這是由于不同水生生物對(duì)污染物的耐受性不同，相同水生生物對(duì)不同污染物的耐受性不同造成的。

化學(xué)物質(zhì)對(duì)生物的毒性作用可根據(jù)其96 h-LC50分為4個(gè)等級(jí)(國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局，2004)：LC50＜1 mg·L-1為極高；LC50=1～10 mg·L-1為高毒；LC50=10～100 mg·L-1為中毒；LC50＞100 mg·L-1為低毒。參照此毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，BPA (96 h-LC50為6.34 mg·L-1)和NP (96 h-LC50為1.09 mg·L-1)對(duì)河蜆均屬于高毒等級(jí)。河蜆對(duì)BPA和NP的耐受順序?yàn)椋築PA＞NP。

3.2 BPA、NP對(duì)河蜆的聯(lián)合作用

BPA-NP對(duì)河蜆的96 h-LC50聯(lián)合作用的類(lèi)型為協(xié)同作用。在質(zhì)量濃度均為一定比例的BPA、NP和二者混合物的96 h-LC50條件下，河蜆呼吸代謝能力差異不明顯，但其抗氧化酶活性已有顯著區(qū)別。BPA、NP單一暴露的情況下，河蜆的SOD和CAT活性與對(duì)照組相比略有不同，但是差異并不十分明顯。而一旦在兩種污染物聯(lián)合暴露下，會(huì)極其顯著地抑制河蜆抗氧化酶活性。說(shuō)明兩種污染物的協(xié)同作用最先表現(xiàn)在對(duì)機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的破壞，進(jìn)而影響生物體的呼吸代謝能力。

3.3 BPA、NP及二者混合物對(duì)河蜆抗氧化酶和呼吸代謝能力的影響

在污染物脅迫下，生物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧等自由基，若不及時(shí)清除，會(huì)破壞生物體內(nèi)的活性氧平衡，從而對(duì)生物體造成氧化損傷，進(jìn)而影響生物體呼吸代謝能力。SOD和CAT作為生物體抗氧化應(yīng)激的第一道防線，通常會(huì)共同起作用，用以清除生物體內(nèi)因污染脅迫產(chǎn)生的自由基。SOD酶是一類(lèi)以O(shè)2-為底物的金屬酶，是抗氧化防御系統(tǒng)酶中最先起作用的一環(huán)，能夠催化生物體內(nèi)超氧陰離子自由基(O2-)發(fā)生歧化反應(yīng)：2O2-+2H+H2O2+ O2，使自由基分解成小分子產(chǎn)物，從而抑制了O2-·向活性最高的自由基·OH的轉(zhuǎn)化(KEHRER, 2000)，而CAT酶作為過(guò)氧化物酶中的代表酶，可以將SOD酶的分解產(chǎn)物H2O2繼續(xù)分解成對(duì)機(jī)體無(wú)害的產(chǎn)物H2O和O2：2H2O22H2O+ O2，從而起到保護(hù)機(jī)體免受外界氧化損傷的作用。

早有研究報(bào)道, 生物體內(nèi)呼吸代謝和抗氧化成分等會(huì)因污染脅迫的存在而改變(Cheung和Cheung，1995；Rodriguez-Ariza等，1993)。前人曾經(jīng)做過(guò)BPA、NP短期暴露影響水生生物呼吸代謝和酶學(xué)指標(biāo)的研究。為研究BPA對(duì)生物抗氧化還原系統(tǒng)的影響，意大利的研究者Canesi等( 2007)研究了注射BPA (3～60 ng/g dw tissue) 24 h之后，海產(chǎn)雙殼貝類(lèi)Mytilus galloprovincialis Lam.的氧化還原狀況的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，BPA改變了包括CAT酶、GST酶的活性以及總谷胱甘肽的含量。Li Mei-Hui研究了包括壬基酚在內(nèi)的8種離子和非離子表面活性劑對(duì)一種淡水渦蟲(chóng)的急性毒性及CAT酶、SOD酶以及膽堿酯酶活性的影響，結(jié)果顯示，0.5 mg·L-1的壬基酚使SOD酶及膽堿酯酶的活性受到抑制(Li，2008)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，BPA、NP及二者混合物均可對(duì)河蜆抗氧化酶及呼吸代謝能力產(chǎn)生一定的抑制作用，這與前人的研究結(jié)果較為一致。

本試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，在BPA、NP單一暴露及聯(lián)合暴露下，河蜆耗氧率和排氨率、SOD和CAT活性均呈現(xiàn)出先下降后上升再下降的趨勢(shì)，其中在BPA、NP和二者混合物的質(zhì)量濃度較低時(shí)，河蜆的耗氧率和排氨率、SOD和CAT活性只有微小降低，隨著質(zhì)量濃度的升高，河蜆耗氧率和排氨率、兩個(gè)酶活性相對(duì)均有所升高，而在質(zhì)量濃度極高時(shí)其耗氧率和排氨率以及兩個(gè)酶活性才又受到顯著性或極顯著性的抑制，這可能是由于在較低的質(zhì)量濃度暴露下，活性氧等自由基，包括氧自由基(O2-)、氫過(guò)氧自由基(HO2-·)、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥基自由基(OH·)等在體內(nèi)不斷積累，導(dǎo)致細(xì)胞受到一定程度的氧化損傷，而此時(shí)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶防御系統(tǒng)等功能尚未被激活，從而導(dǎo)致機(jī)體酶活性降低，而自由基積累，加劇了膜脂過(guò)氧化，使膜的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，因而引起一系列生理生化代謝紊亂，機(jī)體生理代謝功能降低(Cheung和Cheung，1995)，表現(xiàn)為河蜆耗氧率和排氨率的降低；當(dāng)污染物的質(zhì)量濃度逐漸升高時(shí)，體內(nèi)抗氧化作用的酶防御系統(tǒng)(如SOD酶和CAT酶)通過(guò)細(xì)胞應(yīng)激作用產(chǎn)生大量的酶蛋白，從而使得體內(nèi)相關(guān)酶活性有所升高，SOD酶和CAT酶活力的提高可以清除代謝中產(chǎn)生的H2O2, 使生物體不受到較大的氧化損傷，呼吸排泄能力亦有所增強(qiáng)；但當(dāng)污染物的質(zhì)量濃度再次升高并達(dá)到一定閾值時(shí)，推測(cè)由于機(jī)體所含有的自由基已遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致體內(nèi)自由基不斷積累，細(xì)胞受到更為嚴(yán)重的損傷，與此同時(shí)機(jī)體抗氧化作用的酶防御系統(tǒng)也瀕于崩潰，表現(xiàn)為機(jī)體相關(guān)酶活性的降低，生理代謝功能下降。

4 結(jié)論

1) BPA和NP對(duì)河蜆屬于高等毒性的物質(zhì)，且NP對(duì)河蜆的毒性高于BPA。

2) BPA和NP共存時(shí)，對(duì)河蜆聯(lián)合作用為毒性增加的協(xié)同作用。

3) 實(shí)驗(yàn)研究了在BPA、NP單一暴露及聯(lián)合暴露下，河蜆抗氧化酶活性和呼吸代謝能力的變化規(guī)律，探討了以抗氧化酶和耗氧率、排氨率作為污染監(jiān)測(cè)指標(biāo)的可能性。結(jié)果表明，在BPA和NP的單一作用及二者聯(lián)合作用下，SOD、CAT活性和耗氧率、排氨率均表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，具有較好的一致性和規(guī)律性，而且對(duì)BPA和NP的反應(yīng)都比較敏感。因此，可以聯(lián)合河蜆呼吸和排泄過(guò)程中的耗氧率和排氨率以及兩種酶活性變化作為BPA和NP單一污染及聯(lián)合污染的一項(xiàng)早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)，用來(lái)反映水體中BPA和NP的污染狀況。

BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1): 248-254.

CANESI L, BORGHI C, CIACCI C, et al. Bisphenol-A alters gene expression and functional parameters in molluscan hepatopancreas[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2007, 276(1): 36-44.

CHEUNG S G, CHEUNG R Y H. Effects of heavy metals on oxygen consumption and ammonia excretion in green-lipped mussels (Perna viridis) [J]. Marine Pollution Bulletin, 1995, 31(4): 381-386.

HASSELBERG L, MEIER S, SVARDAL A. Effects of alkylphenols on redox status in first spawning Atlantic cod (Gadus morhua)[J]. Aquatic Toxicology, 2004, 69(1): 95-105.

KEHRER J P. The Haber–Weiss reaction and mechanisms of toxicity[J]. Toxicology, 2000, 149(1): 43-50.

LAGAN A, BACALONI A, LEVA I De, et al. Analytical methodologies for determining the occurrence of endocrine disrupting chemicals in sewage treatment plants and natural waters[J]. Analytica Chimica Acta, 2004, 501(1): 79-88.

LI M H. Effects of nonionic and ionic surfactants on survival, oxidative stress, and cholinesterase activity of planarian[J]. Chemosphere, 2008, 70(10): 1796-1803.

MARIE V, BAUDRIMONT M, BOUDOU A. Cadmium and zinc bioaccumulation and metallothionein response in two freshwater bivalves (Corbicula fluminea and Dreissena polymorpha) transplanted along a polymetallic gradient[J]. Chemosphere, 2006, 65(4): 609-617 .

NASU M, GOTO M, KATO H, et al. Study on endocrine disrupting chemicals in wastewater treatment plants[J]. Water Science and Technology, 2001, 43(2): 101-108.

PASCOE D, CARROLL K, KAMTANUT W, et al. Toxicity of 17α-ethinylestradiol and bisphenol A to the freshwater cnidarian Hydra vulgaris[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2002, 43(1): 56-63.

RODRIGUEZ-ARIZA A, PEINADO J, PUEYO C, et al. Biochemical indicators of oxidative stress in fish from polluted littoral areas[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1993, 50(12): 2568-2573.

SEGNER H, NAVAS J M, SCHAFERS C, et al. Potencies of estrogenic compounds in in vitro screening assays and in life cycle tests with zebrafish in vivo[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2003, 54(3): 315-322.

VANDENBERG L N, HAUSER R, MARCUS M, et al. Human exposure to bisphenol A (BPA) [J]. Reproductive Toxicology, 2007, 24(2): 139-177.

VIDAL M L, BASSERES A, NARBONNE J F. Potential biomarkers of trichloroethylene and toluene exposure in Corbicula fluminea[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2001, 9(3): 87-97.

WANG J H, LIU H X, XU T. The role of superoxide dismutase (SOD) in stress physiology and senescence physiology of plant [J]. Plant Physiology Communications, 1989. 1.

WAY C M, HORNBACH D J, MILLER-WAY C A, et al. Dynamics of filter feeding in Corbicula fluminea (Bivalvia: Corbiculidae) [J]. Canadian Journal of Zoology, 1990, 68(1): 115-120.

ZHANG Y Z, SONG X F, KONDOH A, et al. Behavior, mass inventories and modeling evaluation of xenobiotic endocrine-disrupting chemicals along an urban receiving wastewater river in Henan Province, China[J]. Water Research, 2011, 45(1): 292-302.

郭匿春, 謝平. 雙酚 A 和壬基酚對(duì)隆線溞和微型裸腹溞的毒性[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2009, 33(3): 492-497.

國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局. HJ/T 154-2004新化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估導(dǎo)則[S]. 北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社, 2004: 12.

劉其根, 沈和定, 周洪琪, 等. 河蜆的耗氧率和排氨率[J]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 8(4): 298-303.

牛海崗, 王宏元, 張育輝. 雙酚A對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪生長(zhǎng)發(fā)育的毒性效應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2009, 4(3): 408-414.

徐鏡波, 袁曉凡. 過(guò)氧化氫酶活性及活性抑制的紫外分光光度測(cè)定[J].環(huán)境化學(xué), 1997, 16(1): 73-76.

莊惠生, 楊光. 雙酚 A 對(duì)鯉魚(yú)急性和亞急性毒性的研究[J]. 環(huán)境化學(xué), 2005, 24(6): 682-684.

鄒國(guó)林, 桂興芬, 鐘曉凌. 一種 SOD 的測(cè)活方法-鄰苯三酚自氧化法的改進(jìn)[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 1986, 4(4): 71-73.

Effects of BPA and NP on respiratory metabolism and antioxidant enzymes in Asian calm

ZENG Lixuan, ZHANG Yuejun, KANG Yuan, ZHANG Qiuyun
Key Laboratory of Theoretical Chemistry of Environment, Ministry of Education, School of Chemistry and Environment, South China Normal University, Guangzhou 510006, China

In the present study, the effect of BPA and NP on respiratory metabolism and antioxidant enzymes in Asian clam (Corbicula fluminea) including oxygen consumption rate (OCR), the ammonia excretory rate (AER), and the activity of antioxidant enzymes (superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT)) were studied by semi-static method test．The results showed that: ① the 96 h-LC50of BPA and NP were 6.34 and 1.09 mg·L-1, respectively, and they were both categorized as high toxic substances; ② BPA and NP had a synergistic effect on chronic and acute toxicity; ③ In the range of the experimental concentrations(BPA：0.63, 0.79 , 1.59, 3.17 mg·L-1；NP：0.109, 0.136, 0.271, 0.542 mg·L-1；BPA+NP：(0.078 2+0.029), (0.097 8+0.036 3), (0.196+0.072 5), (0.391+0.145) mg·L-1), the response of OCR, AER, SOD and CAT to BPA and NP showed a typical pattern. There was only a minor decrease for the OCR, AER, SOD and CAT at low concentrations of BPA, NP and the mixture, and these activities were up-regulated as the concentrations of pollutants were increased, but they were significantly inhibited when the concentration of pollutants were increased up to 1/2 LC50. The present studies indicated that the OCR, AER, SOD and CAT in clams could be considered as an indicator for pEDCs pollution in early stage.

bisphenol a; nonylphenol; Asian clam (Corbicula fluminea); oxygen consumption rate (OCR); ammonia excretory rate (AER); superoxide dismutase (SOD); catalase (CAT)

X503.225

A

1674-5906（2014）01-0122-07

曾麗璇，張悅君，康園，張秋云. 雙酚A和壬基酚對(duì)河蜆呼吸代謝和抗氧化酶活性的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2014, 23(1): 122-128.

ZENG Lixuan, ZHANG Yuejun, KANG Yuan, ZHANG Qiuyun. Effects of BPA and NP on respiratory metabolism and antioxidant enzymes in Asian calm [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(1): 122-128.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21147003)

曾麗璇(1972年生)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)榄h(huán)境生態(tài)及水污染治理。E-mail: zenglx@scnu.edu.cn

2013-10-11