田淑霞 陳珺明 韓永龍 肖鐵鋼

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海，200233）

丹參酮對肺纖維化大鼠的干預(yù)作用及其機(jī)制研究

田淑霞 陳珺明 韓永龍 肖鐵鋼

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海，200233）

目的：觀察丹參酮對博萊霉素致大鼠肺纖維化的影響及其作用機(jī)制。方法：SD大鼠隨機(jī)分為5組：空白對照組、模型組、地塞米松陽性對照組、丹參酮組、丹參酮加地塞米松組。大鼠氣管內(nèi)注射博萊霉素復(fù)制肺纖維化模型后，各給藥組腹腔注射相應(yīng)藥物，給藥1次d。28 d后處死動物，取固定部位肺組織分別行HE、Masson染色及電鏡進(jìn)行病理組織學(xué)檢查；RT-PCR法檢測丹參酮對大鼠肺組織中uPA、PAI-1 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：與模型組相比，丹參酮組大鼠肺泡炎和肺纖維化程度明顯減輕（P＜0.05，0.01）；uPA顯著升高而PAI-1表達(dá)明顯降低（P＜0.05，0.01）；在與地塞米松聯(lián)合時以上作用更加明顯。結(jié)論：丹參酮對博萊霉素所致大鼠肺纖維化具有一定的治療作用且與地塞米松有協(xié)同作用，其機(jī)制可能與抑制炎性反應(yīng)細(xì)胞的浸潤活化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積及調(diào)控UPA及PAI-1之間平衡有關(guān)。

丹參酮；肺纖維化；UPA；PAI-1；博萊霉素

肺纖維化（Pulmonary Fibrosis，PF）是由多種病因引起的肺泡間質(zhì)性炎性反應(yīng)及進(jìn)行性細(xì)胞外基質(zhì)（Extra Cellular Matrix，ECM）增多沉積的動態(tài)病理過程，進(jìn)而導(dǎo)致肺遠(yuǎn)端有效換氣面積減少，多數(shù)患者最終死于氣道損傷和低氧性呼吸衰竭［1-3］。尿激酶型纖溶酶原激活物（Urokinase-type Plasminogen Activator，uPA）及其抑制物（Urokinase-type Plasminogen Activator-1，PAI-1）是調(diào)節(jié)ECM降解平衡的重要體系。丹參是常見的活血化瘀中藥，丹參酮IIA磺酸鈉是丹參提取物之一丹參酮IIA的水溶性衍生物。近年來許多研究表明，丹參酮IIA具有抗纖維化作用［4-5］。本研究采用博來霉素復(fù)制大鼠肺纖維化模型，觀察觀察丹參酮IIA對肺纖維化大鼠肺組織尿激酶型纖溶酶系統(tǒng)表達(dá)及肺組織超微結(jié)構(gòu)改變的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑 丹參酮IIA磺酸鈉（第一生化藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字：H31022558）；博萊霉素A5，（日本化藥株式會社，批號：640110）；醋酸潑尼松龍片，（上海信誼藥廠有限公司，批號：120122）；逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒（美國Invitrogen公司）；SYBR Green Supermix（日本東洋公司）；兔抗大鼠UPA單克隆抗體試劑盒、羊抗大鼠PAI-1單克隆抗體試劑盒（Santa Cruz Biotechnology INC）。

1.2 動物 雄性SD大鼠50只，SPF級，體質(zhì)量（260±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號為SCXK（滬）2009-0005。

2 方法

2.1 肺纖維化大鼠模型制備、分組與給藥 將實驗大鼠3%戊巴比妥鈉30 mgkg腹腔注射麻醉后，無菌操作下行頸部正中切口，分離氣管。模型組與治療組大鼠氣管內(nèi)注入0.2～0.3 mL含博萊霉素A5（5 mgkg）的生理鹽水，對照組注入等體積生理鹽水，縫合切口并消毒處理，將大鼠直立旋轉(zhuǎn)3 min，使藥液在肺中分布均勻。大鼠隨機(jī)分為5組（每組10只），分別為空白對照組（A組）、模型組（B組）、丹參酮治療組（C組）、潑尼松陽性對照組（D組）、潑尼松聯(lián)合丹參酮治療組（E組）。于成模后第2日，C組和D組大鼠每天分別按10 mgkg和0.4 mgkg體質(zhì)量腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉或潑尼松，E組給藥為C、D組相加。其余2組每日給予等體積蒸餾水腹腔注射，實驗周期為28 d。

2.2 病理學(xué)觀察 迅速取右肺下葉4%多聚甲醛固定48 h，制備石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，Masson三色染色，參照文獻(xiàn)［6-7］將肺泡炎和肺纖維化程度分級：無肺泡炎和肺纖維化；輕度肺泡炎和肺纖維化，受累面積小于20%；中度肺泡炎或肺纖維化，受累面積20%～50%；重度肺泡炎或肺纖維化，受累面積＞50%。一起經(jīng)25 gL戊二醛中固定，按電鏡常規(guī)進(jìn)行標(biāo)本制備。半薄切片后做超薄切片，日本JEM-1230型投射電鏡觀察。

2.3 肺纖維化大鼠uPA及PAI-1基因表達(dá) 提取大鼠左下肺組織總RNA。用分光光度法測定其總RNA含量及純度。用RT試劑盒對總mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，進(jìn)行實時PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系共25μL：cDNA和上下游引物各0.5μL，SYBS green supermix 12.5μL，去離子水11μL。循環(huán)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸45 s，60次循環(huán)，55℃10 min。實時收集熒光信號，數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABIPrism 7300 SDS Software分析，計算出UPA、PAI-1mRNA的相對表達(dá)量。引物由上海英駿生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 UPA、PAI-1和GAPDH引物序列

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，各組計量資料以（±s）表示，用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法，等級資料采用Kruskall-Wallis法或Mann-Whitney法檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 對肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響 HE染色顯示：A組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，毛細(xì)血管正常，肺泡腔完整，無炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤。B組較A組肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚，毛細(xì)血管明顯增生，病變部位廣泛，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。C、D、E組較B組肺泡間隔增寬，極個別肺組織中見到肺泡腔中有單核巨噬細(xì)胞浸潤及出血，程度均較輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Masson染色顯示：A組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯纖維組織增生；B組較A組肺組織結(jié)構(gòu)破壞，重度炎性細(xì)胞浸潤，大面積大量膠原纖維沉積呈束狀而造成肺泡壁明顯增厚及肺泡形態(tài)改變，支氣管、血管周邊廣泛大量膠原沉積，有明顯的間質(zhì)纖維化，纖維化評分明顯較正常組增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與B組相比，C、D、E組可見肺泡壁的增厚，炎性細(xì)胞浸潤減少，肺組織損害減輕，有少量膠原纖維沉積，纖維化評分降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；C組與E組和D組比較，炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織明顯減少，纖維化評分降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖1，表2）。

表2 肺組織炎性反應(yīng)及纖維化評分

病理標(biāo)本電鏡學(xué)觀察：A組：肺泡上皮結(jié)構(gòu)完整，Ⅰ型上皮細(xì)胞胞質(zhì)扁平，其基膜與毛細(xì)血管基膜貼敷緊密，呼吸膜連續(xù)、較厚，Ⅱ型細(xì)胞形態(tài)正常，表面具有絨毛，內(nèi)含嗜鋨性分泌顆粒，為板層狀；細(xì)胞間連接比較緊密，間質(zhì)中有少量纖維，排列松散而稀疏。B組：肺組織整體結(jié)構(gòu)比較疏松，呼吸膜出現(xiàn)分層、扭曲甚至破壞；Ⅱ型細(xì)胞絨毛減少甚至消失，板層小體大部分缺失呈空泡狀；部分Ⅰ型上皮細(xì)胞線粒體腫脹，嵴消失呈空泡。血管內(nèi)皮細(xì)胞核變形，核膜皺折，腔內(nèi)有大量紅細(xì)胞、中性白細(xì)胞，部分胞質(zhì)空泡變性。成纖維細(xì)胞增多，肺間質(zhì)大量纖維不規(guī)則堆積，排列緊密而凌亂。C、D、E組呼吸膜偶見分層或扭曲，連續(xù)性良好；Ⅱ型細(xì)胞絨毛基本正常，板層小體有較多殘留；肺間質(zhì)存在少量纖維（見圖2）。

圖1 光鏡下肺組織病理學(xué)改變

3.2 對肺纖維化大鼠uPA與PAI-1基因表達(dá)的影響

B組大鼠肺組織UPA及PAI-1較A組均明顯增加，但以PAI-1增加更加明顯，C、D、E組大鼠UPA較B組明顯增加而PAI-1明顯降低（P＜0.05，0.01）（見圖3）。

圖2 電鏡下肺組織病理學(xué)改變

圖3 丹參酮對肺纖維化大鼠肺組織中uPA、PAI-1mRNA表達(dá)的影響

4 討論

博萊霉素是一種抗腫瘤藥，其不良反應(yīng)之一是引起肺纖維化。用博萊霉素復(fù)制肺纖維化動物模型，已成為國內(nèi)外公認(rèn)的肺纖維化造模方法［8-9］?？捎糜谘芯糠卫w維化的發(fā)病機(jī)制及藥物篩選。本研究采用博來霉素復(fù)制大鼠肺纖維化模型，對照組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見炎性反應(yīng)及纖維化病灶，而模型組大鼠的肺組織則出現(xiàn)不同程度的肺泡炎性反應(yīng)變化，肺泡間隔增厚，肺泡腔破壞變窄或消失，成纖維細(xì)胞增生，肺間質(zhì)膠原沉積，與文獻(xiàn)報道的肺纖維化病變一致［10-11］。經(jīng)過丹參酮治療后，博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型大鼠肺泡炎及肺纖維化程度明顯減輕，表明丹參酮能減輕肺纖維化過程中的炎性反應(yīng)及纖維化程度。ECM過度沉積是各種器官纖維化的共同表現(xiàn)［12-13］，肺纖維化也不例外［14］。ECM的過度沉積既是ECM合成過多，更大程度上是由于降解的減少引起的［15］。uPA主要參與血管新生、基質(zhì)重構(gòu)、腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移等過程，尤其是ECM的降解，因而與肺纖維化關(guān)系密切［16］。一方面，uPAR與pro-uPA特異結(jié)合后通過自分泌或旁分泌機(jī)制使uPA活化，另一方面，它還與活化的uPA高效結(jié)合，將uPA濃集于細(xì)胞表面，同時纖溶酶原通過其賴氨酸結(jié)合位點與細(xì)胞表面的纖溶酶原受體結(jié)合，兩個系統(tǒng)在細(xì)胞膜上相伴作用，形成一高效的纖溶活化系統(tǒng)，活化的uPA將催化纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，介導(dǎo)ECM蛋白的水解。同時激活的纖溶酶也可作用于pro-uPA，使之變成有活性的uPA，形成一種正反饋現(xiàn)象。PAI是絲氨酸蛋白酶抑制物超家族的成員，包括PAI-1、PAI-2及PAI-3。其中，PAI-1是uPA的主要抑制物［17］。PAI與uPA結(jié)合后被uPA降解，釋放出PAI的羧基端，新產(chǎn)生的C末端精氨酸的羧基與uPA活性中心的絲氨酸的羧基生成酯鍵，從而抑制精氨酸一絲氨酸蛋白酶。PAI-1對uPA的抑制作用及uPa自身對uPAR的降解，共同參與uPA活性的負(fù)向調(diào)節(jié)［18］。一旦有各種致病因子打破這種統(tǒng)一，則使兩者失衡，從而導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展［19］。

正如本實驗顯示，與空白組相比，模型組uPA和PAI-1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且PAI-1的增加更加明顯，從而增加了膠原纖維的積累并促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展。與模型組相比，丹參酮顯著升高了肺組織中PAI-1的表達(dá)，降低PAI-1的表達(dá)，從而證明丹參酮通過提高PAI-1抑制PAI-1而產(chǎn)生抗纖維化的作用。與地塞米松組相比，丹參酮組未表現(xiàn)出明顯差異，而丹參酮與地塞米松聯(lián)合顯示出明顯優(yōu)勢。

總之，本實驗結(jié)果表明，丹參酮抑制博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化過程，提高機(jī)體的抗炎、抗損傷能力，其作用機(jī)制可能與通過調(diào)控UPA與PAI-1之間的平衡，減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積有關(guān)。并且這一作用在與地塞米松聯(lián)合時顯示協(xié)同效應(yīng)。

［1］Feng Y Z，Zhang Y S，Cao Z F，et al.Prevention of combination of Hirsntella sinensis and Panax notoginseng extracts on Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice［J］.Chin Herb Med，2010，2（2）：118-124.

［2］Montes E，Ruiz V，Checa M，et al.Renin is an angiotensin-independent profibrotic mediator：role in pulmonary fibrosis［J］.EurRespir J，2012，39（1）：141-148.

［3］Santos-Silva MA，Pires KM，Trajano ET，etal.Redox imbalance and pulmonary function in bleomycin-induced fibrosis in C57BL6，DBA2，and BALBc mice［J］.Toxicol Pathol，2012，40（5）：731-741.

［4］Wu H，LiY，Wang Y，et al.Tanshinone IIA attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis via modulating angiotensin-converting enzyme2angiotensin-（1-7）axis in rats［J］.Int JMed Sci，2014，11（6）：578-586.

［5］Xu M，Cao F，Liu L，et al.Tanshinone IIA-induced attenuation of lung injury in endotoxemic mice isassociated with reduction of hypoxia-inducible factor1alpha expression［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2011，5（5）：1028 -1035.

［6］Szapiel SV，Elson N A，F(xiàn)ulmer JD，et al.Bleomycin induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse［J］.Am Rev Respir Dis，1979，120：893-899.

［7］Hubner RH，GitterW，Mokhtari N E E，et al.Standardized quantification of pulmonary fibrosis inhistological samples［J］.Biotechniques，2008，44（4）：507-517.

［8］Gharaee K M，Ullenbruch M，Phan SH.Animal modelsof pulmonary fibrosis［J］.Methods Mol Med，2005，117（3）：251-259.

［9］張永勝，馮一中，曹志飛，等.復(fù)方蟲草對博來霉素致大鼠肺纖維化的作用及其機(jī)制［J］.中草藥，2011，42（9）：1766-1772.

［10］Talmadge E King；Annie Pardo；Moisés Selman.Idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Lancet，2011，378（9807）：1949-1961.

［11］王斌勝，劉孟安.肺絡(luò)通合劑對肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)和纖維連接蛋白含量的影響［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，16（17）：195-198.

［12］穆恩，陳松，李鑫，等.Ⅶ因子活化蛋白酶對肺纖維母細(xì)胞增殖和膠原合成的影響［J］.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2011，11（23）：653-657.

［13］肖霞，何振華.轉(zhuǎn)化生長因子-β和肝細(xì)胞生長因子在肺纖維中的研究進(jìn)展［J］.中國實用醫(yī)藥，2010，2（5）：239-241.

［14］Steele MP，Schwartz DA.Molecular mechanisms in progressive idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Annu Rev Med，2013，64：265-276.

［15］Degryse AL，Tanjore H，Xu XC，et al.TGFbeta signaling in lung epithelium regulates leomycin-induced alveolar injury and fibroblast recruitment［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，300（6）：887-897.

［16］張紓難，賈明月，于洋.近5年中醫(yī)呼吸病學(xué)術(shù)發(fā)展述評［J］.世界中醫(yī)藥，2014，9（8）：969-973.

［17］張彥萍，王衛(wèi)麗，劉建，等.纖溶酶原激活物抑制劑-1對大鼠肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2012，12（35）：931-933.

［18］H Ishibashi，Y Nariai，T Kanno，et al.Effects of transforming growth factor beta 1 on the plasminogen activation system，collagen and integrin synthesis，and proliferation of rabbit mandibular condylar chondrocytes［J］.International Journal of Oral＆Maxillofacial Surgery，2014，43（4）：470-475.

［19］Dubis，Joanna Zuk，Natalia，et al.Activity of thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor in the plasma of patients with abdominal aortic aneurysm［J］.Blood coagulation＆fibrinolysis，2014，25（3）：226-231.

（2014-04-15收稿 責(zé)任編輯：王明）

Influence and Mechanism of Tanshinone on Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis in Rats

Tian Shuxia，Chen Junming，Han Yonglong，Xiao Tiegang
（Department of Pharmacy Service，Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University，Shanghai200233，China）

Objective：To investigate the effect of Tanshinone on urokinase-type plasminogen activator（uPA）and urokinase-type plasminogen activator-1（PAI-1）in rats with pulmonary fibrosis and to explore the possible mechanism.Methods：Fifty Spague-Dawley rats were randomly divided into the control group，model group，Tanshinone group，dexamethasone groupand Tanshinone add dexamethasone group.The rats of model group and the treatment group were induced pulmonary fibrosis with bleomycin（5 mgkg）endotracheally，while the rats of other groups were given normal saline instead.After 28 days，rats with Tanshinone treatment by Intraperitoneal injection administration once a day were killed.The rat lung histopathology was examined with HE staining，mass on staining and electron microscope.The influences of Tanshinone on the expression of uPA and PAI-1mRNA in lung tissue of rats with Bleomycin-induced pulmonary fibrosis were assayed by RT-PCR.Results：Compared with the model group，thealveolitis and fibrosis extentwere attenuated after Tanshinone treatment（P＜0.05，0.01），and the expression levels of uPA was increased and PAI-1 mRNA was decreased（P＜0.05，0.01）significantly.Compared with the dexamethasone group，therapeutic effect was more obviously when Tanshinone combine with dexamethasone（P＜0.01）.Conclusion：Tanshinone has a good action against experimental pulmonary fibrosis and has the synergetic effect with dexamethasone.The mechanisms might be related to the inhibition of activation of inflammatory cell infiltration，collagen deposition and regulation of equilibrium between the uPA and PAI-1.

Tanshinone；Pulmonary fibrosis；uPA；PAI-1；Bleomycin

R285.5

A

10.3969j.issn.1673-7202.2014.12.023

上海市浦東新區(qū)中醫(yī)學(xué)科人才培養(yǎng)項目資助項目（編號：PDZYXK-3-2013008）