聶益軍，張瓊

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006；2、江西省人民醫(yī)院，江西南昌330006)

·檢驗(yàn)與臨床·

群體反應(yīng)性抗體特殊檢測(cè)結(jié)果的探討

聶益軍1，張瓊2

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006；2、江西省人民醫(yī)院，江西南昌330006)

目的通過(guò)對(duì)群體反應(yīng)性抗體(panel reaction antibodies，PRA)特殊結(jié)果的探討，了解PRA抗體產(chǎn)生及移植排斥反應(yīng)的免疫學(xué)基礎(chǔ)理論。方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，監(jiān)測(cè)腎移植受者外周血人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)-IgG抗體的水平及其特異性變化。結(jié)果無(wú)傳統(tǒng)致敏因素受者156例中3例產(chǎn)生PRA抗體，百分比為1.92%；產(chǎn)生PRA抗體再次復(fù)查者68例中15例PRA抗體特異性發(fā)生改變，百分比為22.06%；再次移植受者15例中3例未產(chǎn)生PRA抗體，百分比為20%。結(jié)論(1)除妊娠、輸血、移植外，感染也可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生PRA抗體；(2)PRA抗體的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)體免疫反應(yīng)；(3)除PRA抗體外，其它因素(如MICA抗體、次要組織相容性抗體等)也可導(dǎo)致排斥反應(yīng)的發(fā)生。

群體反應(yīng)性抗體；腎移植；排斥反應(yīng)

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.029

腎移植是晚期腎功能衰竭的有效替代治療方法,腎移植的成功與否在很大程度上受到群體反應(yīng)性抗體(PRA)介導(dǎo)的急慢性排斥反應(yīng)的影響。腎移植受者在受到同種抗原人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)免疫致敏后,外周血中容易產(chǎn)生PRA，其中HLA-IgG抗體是引起超急性排斥反應(yīng)的關(guān)鍵因素,并且與急性排斥反應(yīng)、慢性排斥反應(yīng)和移植物功能延遲(DGF)等密切相關(guān)[1]。由于PRA具有在移植前預(yù)測(cè)排斥反應(yīng)和移植后預(yù)警移植物喪失的重要作用，因此目前PRA檢測(cè)已被列入腎移植組織配型的常規(guī)項(xiàng)目并予以監(jiān)測(cè)。在江西省人民醫(yī)院移植中心監(jiān)測(cè)的受體中，筆者發(fā)現(xiàn)有3種特殊檢測(cè)結(jié)果有待討論并進(jìn)行解釋。現(xiàn)將其報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料2012年11月至2013年10月期間擬接受腎移植的受者287例，其中男156例,女121例,年齡16～64歲，平均42.6歲。選取的受者為經(jīng)江西省人民醫(yī)院確診為尿毒癥或腎功能衰竭患者(排除腫瘤、結(jié)核史及神經(jīng)系統(tǒng)病史)，同時(shí)與受者簽訂試驗(yàn)知情同意書(shū)。第一種特殊情況為無(wú)傳統(tǒng)致敏因素而產(chǎn)生了PRA抗體。這些無(wú)傳統(tǒng)致敏因素(即無(wú)輸血、妊娠或移植史)受者156例，其中男94例,女62例,年齡16～62歲，平均41.2歲。第二種特殊情況為已產(chǎn)生PRA抗體再次復(fù)查者，其抗體特異性可發(fā)生改變。已產(chǎn)生PRA抗體再次復(fù)查者68例，其中男45例，女23例，年齡23～64歲，平均45.8歲。第三種特殊情況為再次移植受者未產(chǎn)生PRA抗體。再次移植受者15例，其中男9例，女6例，年齡為38～62歲，平均48.5歲。

1.2 HLA-IgG抗體的監(jiān)測(cè)

1.2.1 試劑美國(guó)One Lambda公司提供的Lambda抗原板(LAT1240)。

1.2.2 HLA-IgG抗體檢測(cè)方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),監(jiān)測(cè)腎移植受者外周血HLA-IgG抗體的水平及其特異性變化[2]。具體步驟如下：(1)用200μl蒸餾水溶解對(duì)照血清，徹底溶解后,加抗體稀釋液1800μl配成1∶10的稀釋液。(2)用300μl抗體稀釋液稀釋待測(cè)150μl血清。(3)在包被了HLA抗原的Tarasaki微孔板第一行中加入10μl稀釋的陽(yáng)性對(duì)照血清，2～6行加入第一人份受檢血清，7～11行加入第二人份的受檢血清，37℃孵育1h。(4)用緩沖液洗滌2次。(5)按1∶100的比例取酶聯(lián)抗體10μl和抗體稀釋液990μl混勻，每孔中加入10μl稀釋的酶聯(lián)抗人IgG抗體，37℃孵育1h。(6)甩干血清，緩沖液洗滌。(7)分別取底物A和B各500μl混勻，每孔加入10μl底物液，37℃避光孵育10～15min。(8)應(yīng)用美國(guó)One Lambda公司專(zhuān)用軟件(HLA fusion1.3.1)分析患者血清中HLA抗體水平及其特異性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料之間采用u檢驗(yàn)，分別將三種特殊情況下的兩類(lèi)人群(即產(chǎn)生新的PRA抗體人群百分比與不產(chǎn)生新的PRA抗體人群百分比)進(jìn)行對(duì)比分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)傳統(tǒng)致敏因素受者156例中3例產(chǎn)生PRA抗體，百分比為1.92%；153例未產(chǎn)生PRA抗體，百分比為98.08%。見(jiàn)表1。

2.2 產(chǎn)生PRA抗體再次復(fù)查者見(jiàn)表1。68例中15例PRA抗體特異性發(fā)生改變，百分比為22.06%；53例PRA抗體特異性未發(fā)生改變，百分比為77.94%。見(jiàn)表1。

2.3 再次移植受者15例中3人未產(chǎn)生PRA抗體，百分比為20%；12例產(chǎn)生PRA抗體，百分比為80%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 群體反應(yīng)性抗體特殊檢測(cè)結(jié)果(%)

3 討論

腎移植是晚期腎功能衰竭的有效替代治療方法，但移植排斥反應(yīng)的發(fā)生仍然嚴(yán)重困擾著臨床移植。根據(jù)美國(guó)UNOS近期對(duì)57303例腎移植的數(shù)據(jù)分析，影響腎移植存活率的前五個(gè)因素為：移植手術(shù)與相關(guān)維護(hù)、供者死亡原因、HLA配型、PRA百分比、供者年齡。五個(gè)因素中移植手術(shù)與相關(guān)維護(hù)、HLA配型、PRA百分比涉及到較多的技術(shù)問(wèn)題，所以PRA檢測(cè)對(duì)提高腎移植的存活率具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[3，4]。PRA是指腎移植受者體內(nèi)存在的抗HLA抗體。反復(fù)輸血、妊娠、移植失敗等情況均使受者體內(nèi)出現(xiàn)PRA抗體,導(dǎo)致患者預(yù)致敏情況[5]。資料表明,腎移植受者體內(nèi)的抗HLA抗體水平的高低，可反映患者的預(yù)致敏程度,對(duì)移植物的術(shù)后效果影響非常明顯。術(shù)前檢測(cè)患者體內(nèi)PRA水平,能夠幫助外科醫(yī)生合理選擇供、受者和移植時(shí)機(jī),有效提高移植物的生存率及有效率。

在大多數(shù)文獻(xiàn)中均有報(bào)道，通過(guò)妊娠、輸血、移植可造成免疫系統(tǒng)接觸另一個(gè)體的同種抗原，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)激活從而產(chǎn)生PRA抗體[5]。從結(jié)果2.1 中筆者發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有上述原因的病人也會(huì)出現(xiàn)PRA抗體，這些抗體的產(chǎn)生可能與感染的微生物發(fā)生交叉反應(yīng)有關(guān)。這些感染的微生物可能在分子水平上與HLA抗原結(jié)構(gòu)相似，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生PRA抗體。移植抗原作為外源性抗原刺激免疫系統(tǒng),產(chǎn)生移植抗原的特異性免疫應(yīng)答,是移植排斥反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。在恰當(dāng)外在干預(yù)下,甚至可“誘騙”受體免疫系統(tǒng),產(chǎn)生針對(duì)移植抗原的特異性免疫耐受[6，7]。

機(jī)體在受到致敏原的刺激下產(chǎn)生PRA抗體是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)體免疫反應(yīng)，其機(jī)理至今尚未完全闡明，但可以肯定的是機(jī)體所產(chǎn)生的PRA抗體是一種多克隆抗體。迄今為止,我們所談的HLA抗體都是通過(guò)特殊群體細(xì)胞或抗原檢測(cè)出來(lái)的，并且許多研究所用的細(xì)胞并非直接來(lái)自供者。發(fā)生腎移植排斥的患者所擁有抗體的特異性，并不同于被動(dòng)免疫所獲得的抗體特異性。根據(jù)Ceppellini等研究發(fā)現(xiàn),雖然通過(guò)挑選受體和供體以期獲得單價(jià)特異性血清，然而免疫或致敏常常產(chǎn)生額外的抗體特異性，其原因尚不清楚[8]。雖然一些患者可以通過(guò)治療調(diào)節(jié)抗體的產(chǎn)生，降低了抗體水平，但對(duì)另一部分患者經(jīng)過(guò)治療后依然保持抗體高滴度與寬特異性，許多年后抗體水平仍然沒(méi)有降低。目前還不太了解抗體水平下降的調(diào)節(jié)因素。上述理論在一定程度上解釋了結(jié)果2.2(有些患者PRA抗體發(fā)生了改變)。從等待移植患者體內(nèi)剔除抗體，經(jīng)過(guò)治療后PRA抗體陰性的病例也逐漸增多，但也并不總是成功[9]。目前越來(lái)越多中心在腎移植治療中采用不同剔除抗體的方法，常采用的方法有免疫抑制劑、血漿置換、免疫吸附和靜脈注射免疫球蛋白等方法[10]。

從結(jié)果2.3中筆者發(fā)現(xiàn)移植排斥反應(yīng)后也可能PRA陰性。再次移植患者未檢出PRA抗體有兩種可能，一是患者體內(nèi)確實(shí)未產(chǎn)生抗體，二是患者體內(nèi)的PRA抗體是我們暫時(shí)不能檢測(cè)到的HLA抗體。腎移植排斥反應(yīng)的發(fā)生有免疫性和非免疫性因素，其中非免疫性因素包括移植手術(shù)和相關(guān)維護(hù)、供者年齡和死亡原因等；免疫性因素主要有HLA抗體(即PRA)的影響,同時(shí)影響移植物的抗體也可能是針對(duì)非HLA抗原的抗體。在發(fā)生排斥的腎移植患者血清中發(fā)現(xiàn)的MICA抗體(抗人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體I類(lèi)相關(guān)鏈A抗原抗體),引起了人們的關(guān)注，因這些抗體是在內(nèi)皮細(xì)胞而非淋巴細(xì)胞上檢測(cè)到的。在排斥同種異體移植物的患者體內(nèi)，抗體也有針對(duì)上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞系的[11]。次要組織相容性位點(diǎn)并不是HLA。研究顯示，HLA匹配的器官移植患者中還是有出現(xiàn)排斥反應(yīng)、腎功延遲、移植腎切除的一部分患者,由此可以證實(shí)除HLA外還有一些另外的免疫因素參與了排斥反應(yīng)。MICA屬于HLA-Ⅰ類(lèi)分子,組成、表達(dá)和產(chǎn)物與HLA-Ⅰ類(lèi)不大相同,有不同的基因等位,多態(tài)性不如經(jīng)典的HLA基因數(shù)量多但其表達(dá)水平很高,而針對(duì)次要組織相容性位點(diǎn)的抗體還未被發(fā)現(xiàn)?？贵w是體液免疫理論中關(guān)鍵的激發(fā)因素，但抗體是怎樣通過(guò)一系列活動(dòng)來(lái)產(chǎn)生損害尚待查明。

綜上所述，PRA抗體檢測(cè)在腎臟移植中具有無(wú)可替代的作用，但PRA抗體的產(chǎn)生受多種因素的調(diào)節(jié)。在實(shí)際工作中，應(yīng)根據(jù)患者的病情及臨床治療等因素綜合考慮才能更好地對(duì)PRA結(jié)果進(jìn)行合理的解釋或理解。

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R446.62，R392.4

A

1674-1129(2014)06-0728-02

2014-07-18；

2014-09-25)