魏丹丹，劉洋，鄧瓊，徐群飛，萬臘根

(南昌大學第一附屬醫(yī)院，1、檢驗科；2、感染科，江西南昌330006)

·論著·

124株金黃色葡萄球菌的耐藥性分析及PVL基因檢測

魏丹丹1，劉洋1，鄧瓊2，徐群飛1，萬臘根1

(南昌大學第一附屬醫(yī)院，1、檢驗科；2、感染科，江西南昌330006)

目的調查了解我院臨床分離的124株金黃色葡萄球菌的耐藥譜特征及PVL基因攜帶狀況,為臨床合理使用抗菌藥物提供科學依據。方法采用Vitek2 Compact全自動微生物鑒定儀進行菌株鑒定及藥物敏感試驗，PCR法檢測mecA基因、mecC基因和PVL基因。結果耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的檢出率為56.45%(70/124)，MRSA主要分離自燒傷病區(qū)，其次是神經外科ICU。MRSA菌株對青霉素G均耐藥；對左氧氟沙星、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、復方新諾明和利福平的耐藥率分別為57.1%、67.1%、85.7%、80.07%、28.6%、37.1%；MRSA對多種常用抗菌藥物的耐藥率普遍高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；MRSA和MSSA對呋喃妥因、喹奴普?。_福普汀、利奈唑胺的耐藥率分別為2.9%、11.4%、2.9%；0.0%、5.6%、5.6%，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。檢出6株PVL陽性，其中MRSA和MSSA各占3株。結論我院分離的金黃色葡萄球菌對抗菌藥物呈多重耐藥性,MRSA菌株耐藥率明顯高于MSSA,應加強對MRSA的監(jiān)測,指導臨床合理使用抗菌藥物，加強對呋喃妥因、喹奴普?。_福普汀、利奈唑胺耐藥菌株的檢測及PVL基因的檢測，防止此類菌株的播散。

金黃色葡萄球菌；MRSA；耐藥性；殺白細胞素

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.009

金黃色葡萄球菌可引起皮膚軟組織感染和身體其他部位的廣泛感染，是醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的常見病原菌之一[1]。我院作為江西省最大的省級三級甲等綜合性醫(yī)院之一，前期臨床監(jiān)測結果顯示，金黃色葡萄球菌的耐藥問題顯著突出，尤其是MRSA,呈多重耐藥，嚴重影響臨床抗感染的治療，而攜帶有PVL基因的金黃色葡萄球菌主要引起化膿性皮膚感染和壞死性肺炎，使治療更為棘手。本研究旨在對我院臨床分離的124株金黃色葡萄球菌進行耐藥性分析及PVL基因檢測，以指導臨床醫(yī)生合理選擇抗生素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源收集2013年6月至2013年12月南昌大學第一附屬醫(yī)院臨床各種標本分離的124株非重復的金黃色葡萄球菌作為實驗菌株。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923，由本實驗室保存。

1.1.2 主要儀器和試劑法國生物梅里埃公司的Vitek2 Compact全自動微生物鑒定儀、德國Eppendorf公司的MyGenie96/384型PCR儀、美國BIO. RAD公司的DYY-6D型電泳儀、北京六一公司的凝膠成像儀；PCR試劑和DNAMarkerI購于TaKaRa大連寶生物公司。

1.1.3 相關擴增引物相關引物由上海生工生物技術有限公司合成。見表1。

表1 引物序列名稱及相應序列

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和藥敏試驗分離培養(yǎng)后的可疑菌株由Vitek2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進行鑒定及藥敏試驗，藥敏判斷標準及質控遵循2011年版CLSI標準執(zhí)行。

1.2.2 MRSA的鑒定通過表型和基因型檢測進行MRSA鑒定。表型檢測：采用頭孢西丁最低抑菌濃度(MIC)法，由Vitek2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進行鑒定。基因型檢測：溶菌酶煮沸法提取細菌DNA，采用PCR法檢測mecA、mecC基因，反應體系：總反應體積25μl,其中10×buffer 2.5μl(含MgCl2)，dNTPs2μl，rTaq酶0.125μl，上下游引物各0.5μl，DNA模板3μl，雙蒸水補足25μl。反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1.2.3 PVL基因檢測細菌DNA提取同上，反應條件同上。

1.2.4 擴增產物電泳PCR產物在1.2%的含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中進行電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果,將陽性擴增產物送上海生工生物有限公司測序，并在GenBank(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／blast／)進行比對分析。

2 結果

2.1 MRSA的檢測結果124株金葡菌有65株對頭孢西丁耐藥，表型檢出率為52.4%，124株金葡菌有64株攜帶mecA基因，均未檢出mecC基因，基因型檢出率為51.7%，檢出6株對頭孢西丁耐藥而mecA基因陰性菌株，5株mecA基因陽性,頭孢西丁敏感菌株，參照2011年版CLSI標準，攜帶有mecA基因或苯唑西林、頭孢西丁耐藥的金黃色葡萄球菌為MRSA，則MRSA的檢出率為56.45%(70/ 124)。

2.2 MRSA與MSSA耐藥率比較全部MRSA菌株對青霉素G耐藥；對左氧氟沙星、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、復方新諾明和利福平的耐藥率分別為57.1%、67.1%、85.7%、80.07%、28.6%、37.1%。MRSA對多種常用抗菌藥物的耐藥率普遍高于MSSA(P＜0.05)。MRSA和MSSA對呋喃妥因、喹奴普汀／達福普汀、利奈唑胺的耐藥率分別為2.9%、11.4%、2.9%；0.0%、5.6%、5.6%(P＞0.05)。未發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥菌株。MSSA和MRSA對抗菌藥物的敏感性詳見表2。

2.3 PVL基因檢測124株金黃色葡萄球菌檢出6株PVL基因陽性，檢出率為4.84%，其中MRSA和MSSA各占3株，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.11，P＞0.05)。

3 討論

金黃色葡萄球菌是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的常見病原菌之一[1],青霉素的問世曾一度使金黃色葡萄球菌的感染得到了控制，然而，隨之產生的即是抗生素的耐藥問題，自1961年臨床首次發(fā)現(xiàn)MRSA以來，MRSA的分離率逐年上升，其多重耐藥性導致醫(yī)療費用增加，死亡率升高，給臨床治療帶來挑戰(zhàn)[2，3]。

MRSA的耐藥性是由于產生了一種由mecA基因介導編碼的青霉素結合蛋白2a(PBP2a)，PBP2a為葡萄球菌青霉素結合蛋白PBP2的異構體，同樣具有轉肽酶活性，但與PBP2不同的是PBP2a與β-內酰胺類抗菌藥物結合力較弱。由于β-內酰胺類不能抑制PBP2a的轉肽酶活性，致使細菌的細胞壁依然能夠合成而得以生存[4]。國外不斷研究報道檢出除mecA基因以外的新的基因型mecC[5],國內還沒有相關的報道,本研究未檢測出mecC基因。

本研究臨床分離的MRSA占56.45%(70/124)，高于2011年中國CHINET細菌耐藥監(jiān)測報道的全國15所醫(yī)院的平均檢出率50.6%[6]，菌株主要分離自燒傷病區(qū)，燒傷患者由于各種屏障多遭到不同程度的破壞，所以更容易引起各種感染。藥敏結果顯示：我院分離的MRSA具有多重耐藥性，其對多種常用抗生素的耐藥率普遍高于MSSA,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，MRSA和MSSA均出現(xiàn)不同程度地對呋喃妥因、喹奴普?。_福普汀、利奈唑胺耐藥菌株，表明我院金黃色葡萄球菌耐藥性嚴重，應加強微生物室與臨床醫(yī)生的聯(lián)系和溝通，適時進行實驗室監(jiān)測，盡量避免此類耐藥菌株在臨床大量出現(xiàn)，防止其在醫(yī)院內的擴散和流行。本研究未發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥菌株，說明萬古霉素仍可作為金黃色葡萄球菌感染的首選藥物，但自1996年日本首次報道了萬古霉素不敏感菌株Mu3(萬古霉素MIC為4.0μg/ml)[7],2002年美國從臨床檢出世界上第1株攜帶vanA基因的VRSA(耐萬古霉素SAU)以來[8]，國內外報道萬古霉素不敏感株(VISA)或萬古霉素耐藥株(VRSA)不斷增多，提示需要加強對萬古霉素的耐藥監(jiān)測。

本研究中出現(xiàn)了6株對頭孢西丁耐藥而mecA基因陰性的菌株，分析原因可能與菌株產生高水平的β-內酰胺酶或存在PBP2a以外的低親和力PBP有關，還需進一步證實。另外，還發(fā)現(xiàn)5株mecA基因陽性,但對頭孢西丁敏感的臨床菌株,可能與mecA基因本身的表達受到抑制或其輔助基因失活有關，其機制還需要作進一步研究。表型與基因型不一致的現(xiàn)象,可能還受環(huán)境因素的影響,如生長溫度、培養(yǎng)時間、pH值、滲透壓、二價金屬離子等[9]，造成MRSA耐藥程度的差異,從而影響MRSA的檢測結果。

殺白細胞毒素(PVL)是金黃色葡萄球菌產生的一種可以導致嚴重壞死性疾病的毒素，攜帶有PVL基因的金黃色葡萄球菌通常與皮膚軟組織感染相關,特別是蜂窩組織炎、膿腫、癤腫等疾病,甚至導致壞死性肺炎，有較高的死亡率[10，11]，PVL在社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA)中攜帶率較高，而在醫(yī)院相關性MRSA(HA-MRSA)中攜帶率較低。本研究中，124株金黃色葡萄球菌中有6株PVL陽性，陽性率為4.84%，低于李春[12]等人報道的PVL陽性率4.9%，其中MRSA和MSSA各占3株，均主要分離自外科病區(qū)，提示醫(yī)護人員應嚴格遵守無菌操作，防止此類菌株的播散。盡管本院PVL基因的檢出率較低，由于金葡菌廣泛分布于各科室，適時加強對PVL基因的監(jiān)測，對做好醫(yī)院感染控制，及時采取有效的隔離措施，有十分重要的意義。

總之，我院金黃色葡萄球菌的耐藥現(xiàn)狀嚴重，作為臨床實驗室，我們應正確、及時地對金黃色葡萄球菌的耐藥性進行監(jiān)測和流行病學研究，為臨床提供準確、可靠的用藥依據，同時加強與臨床醫(yī)生的聯(lián)系與溝通，并通過提高感染性疾病的標本送檢率來嚴格控制抗菌藥物的使用。作為醫(yī)護人員應嚴格遵守無菌操作原則，從而延緩細菌耐藥株發(fā)生，帶來強大的社會經濟效益。

表2 MSSA和MRSA對常用抗菌藥物的耐藥率(%)

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Drug resistance and PVL gene detection of 124 strains of Staphylococcus aureus

WEI Dandan,LIU Yang，DENG Qiong,et al.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

Objective To investigate the drug-resistance and carriage of Panton-Valentine leukocidin(PVL)gene of 124 Staphylococcus aureus isolated from the hospitalized patients to guide the clinical treatment.Methods 124 Staphylococcus aureus isolates were tested by Vitek 2 Compact automatic microorganism identifying,and the drug sensitivity tests were also performed by it.MecA gene、mecC gene and PVL gene were detected by PCR.Results Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)accounted for 56.45%(70/124),which mainly came from Burns ward and secondly came from Neurosurgery Intensive Care Unit (NICU).All MRSA strains were resistant to penicillin G,and the resistance rates of levofloxacin,gentamicin,erythromycin,tetracycline,SMZ-TMP and rifampicin were 57.1%,67.1%,85.7%,80.07%,28.6%and 37.1%,repectively.For many drug resistances, there was statistical difference between MRSA and methicillin susceptible Staphylococcus aureus(MSSA)(P＜0.05).The drug resistance rates of MRSA were 2.9%,11.4%,2.9%in Nitrofurantoin,Quinupristin-Dalfoprisdn and Linezolid,0.0%,5.6%,5.6%referring to MSSA.6 of 124 Staphylococcus aureus carried PVL genes.Conclusions The Staphylococcus aureus strains from our hospital were multi-drug resistant for antibiotics,and the drug resistance rate of the MRSA strains was higher than the MSSA strains. The surveillance of MRSA should be strengthened to guide clinical medicine,the same with the surveillance of Nitrofurantoin, Quinupristin-Dalfoprisdn and Linezolid resistant Staphylococcus aureus and PVL genes.

Staphylococcus aureus；MRSA；Drug-resistance；PVL

R446.6，Q939.92，R378.1+1

A

1674-1129(2014)06-0677-03

2014-08-08；

2014-09-23)

江西省教育廳青年科學基金項目編號：GJJ14178

魏丹丹，女，1987年出生，南昌大學醫(yī)學院在讀研究生，主攻臨床微生物學及常見細菌致病性及耐藥性機制的研究。

萬臘根，碩士生導師。