孫瑜，彭繼紅，李國良

(江西省血液中心，江西南昌330077)

·論著·

江西地區(qū)1927例骨髓捐獻(xiàn)人群HLA-A、B、DRB1的多態(tài)性探討

孫瑜，彭繼紅，李國良

(江西省血液中心，江西南昌330077)

目的分析江西地區(qū)骨髓捐獻(xiàn)人群人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)A、B、DRBl等位基因的多態(tài)性分布特征。方法應(yīng)用流式-序列特異性寡核苷酸探針方法(Flow-SSO)與直接測序法(SBT)檢測江西地區(qū)1927例骨髓捐獻(xiàn)者的HLA-A、B、DRBl基因座位，采用Arlequin3.5軟件計算HLA等位基因頻率、單倍型頻率和連鎖不平衡參數(shù)等。結(jié)果低分辨狀態(tài)下3個基因座分別檢出17、29和12個等位基因，3個座位分布頻率最高的等位基因分別是HLA-A*02(0.3064)、HLAB*40(0.1889)和HLA-DRBl*9(0.1917),最常見的單倍型為HLA-A*02-B*46-DRBl*09(0.0721)。該人群HLA-A、B、DRBl等位基因在高分辨檢測情況下分布不符合Hardy-Weinherg平衡(P＜0.05)。結(jié)論江西地區(qū)骨髓捐獻(xiàn)人群HLA-A、B、DRBl等位基因和單倍型具有較高的遺傳多態(tài)性。

HLA；多態(tài)性；中華骨髓庫

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.004

人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是人類最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)[1]。其等位基因和單倍型頻率在不同人群中存在明顯差異，這些差異對人群的起源、進(jìn)化、遷徙及與其他人群的親緣關(guān)系等研究具有重要意義[2]。

本研究中我們應(yīng)用流式-序列特異性寡核苷酸探針方法(Flow-sequence specific oligonucleotide probe，F(xiàn)low-SSO)與PCR-直接測序法(polymerase chain reaction-sequence-based typing,PCR-SBT)對2009-2011年1927名江西籍無親緣關(guān)系健康漢族個體骨髓庫捐獻(xiàn)人群進(jìn)行了HLA-A、B和DRB1座位基因的高分辨分型，并對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 對象2009年至2011年健康、無血緣關(guān)系的江西本地漢族造血干細(xì)胞志愿捐獻(xiàn)者1927例，根據(jù)知情同意原則采集EDTA抗凝靜脈全血5ml。

1.2 DNA提取應(yīng)用美國Gentra公司手工提取全血基因組DNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書獲取DNA，使用紫外分光光度儀檢測DNA濃度與純度，調(diào)整至DNA濃度20～100ng/μl，純度1.7～2.0。

1.3 HLA-A、B和DRBl基因分型

1.3.1 Flow-SSO方法采用Flow-SSO分型試劑盒(德國諾詩康瀛公司)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，結(jié)果由Luminexl00 IS分析軟件自動判讀。

1.3.2 PCR-SBT方法對Flow-SSO方法顯示結(jié)果模棱兩可者采用PCR-SBT分型試劑盒(德國諾詩康瀛公司)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，結(jié)果由軟件自動判讀。

1.4 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Arlequin3．5軟件[3]，采用最大數(shù)學(xué)預(yù)期值算法(expectation-maximization，EM)估算基因頻率和單倍型頻率，行Hardy-Weinberg平衡檢驗，檢驗水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 HLA-A、B、DRBl基因頻率在A、B、DRBl座位的低分辨水平上分別檢出了17、29和12個等位基因，高分辨水平上分別檢出了45、82和46個等位基因。3個座位分布頻率最高的等位基因分別是A*02(0.3064)、B*40(O.1889)和DRBl*09(0.1917) (表1)。

表1 江西地區(qū)漢族HLA-A、B、DRBl座位等位基因及頻率(n=1927)

2.2 HLA-A*-B*-DRBl*單倍型頻率低分辨狀態(tài)下共觀察到646種單倍型，最常見者為A*02-B*46-DRBl*09(0.0721)(表2)；高分辨狀態(tài)下共觀察到1621種單體型，最常見者為A*02∶07-B*46∶01-DRBl*09∶01(0.0602)

表2 江西漢族頻率大于0.005的HLA-A＊-B＊-DRBl＊單倍型分布

2.3 Hardy-Weinberg平衡調(diào)查該群體的3座位基因，以高分辨結(jié)果判斷,三基因座的雜合度觀察值與期望值的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,顯示各位點基因型分布均偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)(表3)。

表3 三基因座Hardy-Weinberg平衡檢驗

3 討論

作為人類免疫系統(tǒng)的重要成員，HLA基因位于6號染色體短臂上，表達(dá)產(chǎn)物為細(xì)胞表面的肽受體，可以結(jié)合來自細(xì)胞內(nèi)外的肽而形成HLA-肽復(fù)合物，抗原遞呈細(xì)胞將此復(fù)合物遞呈給T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞分化發(fā)育，啟動免疫應(yīng)答。

HLA基因有著明顯的人種分布特異性，已有許多關(guān)于其基因分布的報道[4,5]。目前，三座位單體型頻率被用于研究人種之間和民族之間的遺傳學(xué)差異[6],估計找到HLA匹配供者所需要骨髓庫供者數(shù)[7]等。

本研究中我們采用Flow-SSO基因分型技術(shù)及SBT技術(shù)與對中國江西地區(qū)1927名健康漢族個體進(jìn)行HLA-A、B、DRBl座位基因分型，在低分辨水平上,江西地區(qū)漢族人群HLA-A、B、DRBl三個座位分別檢出17、29和12個等位基因，這些等位基因理論上可以組合成17×29×12共計5916種A*-B*-DRBl*單倍型，但實際只觀察到646種，占理論數(shù)的10.92%,而高分辨的單倍型所占理論數(shù)更少(1621/169740),該數(shù)據(jù)提示在江西地區(qū)人群中HLA單體存在顯著的連鎖不平衡，具體情況我們將另文討論。低分辨情況下，江西地區(qū)漢族人群中頻率大于0.01的三座位單倍型有16種，均由江西地區(qū)常見等位基因組成[8,9]，其中最常見的單倍型是A*02-B*46-DRBl*09，而高分辨的狀態(tài)顯示，該單倍型主要是由A*02∶07-B*46∶01-DRBl*09∶01構(gòu)成，該數(shù)據(jù)與廣州人群相似[10],一方面提示攜帶這種單倍型的器官或造血干細(xì)胞移植患者在本地漢族人群找到HLA相匹配供者的概率較高，另一方面也提示江西人群與廣州人群可能存在地緣關(guān)系的相近之處。

從Hardy-Weinberg平衡檢驗來看,某些位點的基因分布偏離H-W平衡,在一些研究中也有報道[4,5]，這可能與罕見基因的干擾、樣本量、樣本選擇壓力等相關(guān),該偏離有望隨著樣本量的進(jìn)一步擴(kuò)大而得到糾正,我室的結(jié)果推導(dǎo)出同樣的結(jié)論。我室曾對江西地區(qū)漢族人群的HLA中低分辨率結(jié)果行Hardy-Weinberg平衡檢驗，結(jié)果顯示該人群均處于遺傳平衡狀態(tài)[8,9]，但對3個座位的高分辨基因型分布行Hardy-Weinberg平衡檢驗的結(jié)果則與之相反，說明高分辨細(xì)化了實驗結(jié)果，如使用HLA高分辨基因型驗證人群是否處于遺傳不平衡狀態(tài)，須獲得更多的HLA數(shù)據(jù)支持。有學(xué)者以超過12000例骨髓庫標(biāo)本的數(shù)據(jù)研究[11]，其統(tǒng)計學(xué)分析表明，以該研究樣本數(shù)求單體型頻率，在單體型頻率低于0.000123時結(jié)果不一定可靠，唯一的解決之道是繼續(xù)增加樣本數(shù)，我們僅對1927份標(biāo)本的高分辨結(jié)果進(jìn)行H-W平衡檢驗，樣本量低應(yīng)為最主要原因。

本研究對Flow-SSO結(jié)果模棱兩可者行SBT檢測，發(fā)現(xiàn)二者在中低分辨結(jié)果上吻合性相當(dāng)好，顯示出Flow-SSO法為大批量標(biāo)本HLA檢測的可行性方法。本研究還提示HLA配型實驗室除應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量控制外，應(yīng)至少建立兩種HLA方法或常備兩種以上HLA分型試劑．以便相互驗證，同時證明PCR-SBT為HLA檢測之金標(biāo)準(zhǔn)。

有學(xué)者認(rèn)為[11],評估干細(xì)胞資料庫質(zhì)量和效益主要考慮兩個因素，供者HLA分型的準(zhǔn)確性和初次查詢中病人配到HLA匹配供者的機(jī)會。根據(jù)人群特點，得出本地區(qū)干細(xì)胞資料庫HLA三座位單體型頻率數(shù)據(jù)，將有利于快速計算在骨髓庫中發(fā)現(xiàn)匹配供者的概率，評估骨髓庫供者的數(shù)量和民族背景的組成是否適用于臨床需要，對于制定長遠(yuǎn)的骨髓庫發(fā)展計劃大有裨益。

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Analysis of HLA-A，B，and DRBl polymorphism of 1927 bone marrow donors in Jiangxi

SUN Yu,PENG Jihong,LI Guo-Liang.HLA Laboratory,Jiangxi Blood Center，Nanchang 330077,P．R．China

Objective To investigate allelic and haplotypic polymorphisms of human leukocyte antigen(HLA)genes at A，B and DRBl loci in native Han population of Jiangxi.Methods A total of 1927 unrelated Han ethnic individuals from Jiangxi regions were genotyped by Flow-sequence specific olignucleotide probe(Flow-SSO)and polymerase chain reaction-sequence-based typing(PCR-SBT)for HLA-A，B and DRBl loci.Allelic and haplotypic frequencies were estimated by maximum likelihood estimation method(EM)using Arlequin 3.5 software.Results A total of 17,29 and 12 alleles were observed at HLA-A，B and DRBl loci respectively.The most frequent alleles were A*02(0.3064),B*40(0.1889)and DRBl*9(0.1917).The most common haplotype was A*02-B*46-DRBl*09(0.0721).Conclusion The HLA-A，B and DRBl loci are highly polymorphic in native Han population of Jiangxi province.

Human leukocyte antigen(HLA)；Polymorphism；China Marrow Donor Program(CMDP)

R457.7,R446.62

A

1674-1129(2014)06-0661-03

2014-09-30；

2014-11-05)

江西省科技支撐計劃項目(編號：BSA13700)

孫瑜，女，出生于1976年11月，醫(yī)學(xué)碩士，副主任技師，研究方向為免疫遺傳學(xué)。

李國良，男，出生于1968年11月，醫(yī)學(xué)碩士，主任醫(yī)師，研究方向為免疫遺傳學(xué)。