李志，黃俊明

(廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州510430)

·論著·

斑馬魚毒性檢測(cè)方法的優(yōu)化及應(yīng)用研究

李志，黃俊明

(廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州510430)

目的通過(guò)優(yōu)化斑馬魚急性毒性檢測(cè)方法，檢測(cè)和分析輔酶Q、低聚果糖、雙酚A對(duì)斑馬魚的毒性作用，探討其在食品安全性檢測(cè)與評(píng)價(jià)中的應(yīng)用前景。方法優(yōu)化試驗(yàn)用斑馬魚的基本條件、非水溶性和水中溶解度較低的受試物的處理要求和斑馬魚急性毒性試驗(yàn)條件,觀察和記錄斑馬魚在不同濃度的輔酶Q、低聚果糖、雙酚A的試驗(yàn)溶液中暴露48h的毒性反應(yīng)和死亡情況，檢測(cè)和分析不同濃度的輔酶Q、低聚果糖、雙酚A對(duì)斑馬魚的毒性作用。結(jié)果斑馬魚在劑量為100～1000mg/ L的輔酶Q試驗(yàn)溶液中飼養(yǎng)48h，未發(fā)現(xiàn)斑馬魚有任何毒性反應(yīng)，輔酶Q對(duì)斑馬魚的48hLC50為大于1000mg/L；斑馬魚在劑量為100～1000mg/L的低聚果糖試驗(yàn)溶液中飼養(yǎng)48h，未發(fā)現(xiàn)斑馬魚有任何毒性反應(yīng)，低聚果糖對(duì)斑馬魚的48hLC50為大于1000mg/L；斑馬魚在劑量為10mg/L的雙酚A試驗(yàn)溶液飼養(yǎng)3h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在劑量為8mg/L的雙酚A試驗(yàn)溶液飼養(yǎng)6h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在劑量為6mg/L的雙酚A試驗(yàn)溶液飼養(yǎng)12h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，雙酚A對(duì)斑馬魚的48hLC50為7.15mg/L。結(jié)論本研究顯示優(yōu)化的斑馬魚急性毒性檢測(cè)方法能夠快速檢測(cè)食品和食品污染物的急性毒性，其在食品安全性檢測(cè)與評(píng)價(jià)中將有較好應(yīng)用前景。

斑馬魚；急性毒性；雙酚A；優(yōu)化

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.003

近年來(lái)，三聚氰胺、蘇丹紅、瘦肉精、塑化劑等食品安全事件的不斷涌現(xiàn)，食品安全問(wèn)題無(wú)疑已成為民生問(wèn)題中的重中之重。如何以已發(fā)生的食品安全事件為鑒，為人民群眾的飲食安全提供更好的保障已成為擺在我們面前的重大課題，如何建立快速、有效的毒性檢測(cè)方法，加強(qiáng)食品安全相關(guān)檢測(cè)和評(píng)價(jià)，已成為了目前最需要迫切解決的問(wèn)題。

斑馬魚(zebrafish),又名藍(lán)條魚、花條魚、斑馬擔(dān)尼魚,屬于輻鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔(dān)尼魚屬(Danio)的一種硬骨魚，是脊椎動(dòng)物，具有近似人類的各種器官系統(tǒng)，采用斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，與大、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，而且以水生動(dòng)物代替嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可能是較好推動(dòng)動(dòng)物替代的方法之一。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織在20世紀(jì)80年代推薦斑馬魚為毒性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用魚，目前斑馬魚已經(jīng)列為健康毒性和環(huán)境毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)魚類,試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)可以在國(guó)際上認(rèn)證[1]。

目前在我國(guó)尚無(wú)以斑馬魚模式動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行食品安全性檢測(cè)與評(píng)價(jià)的檢測(cè)方法，雖然斑馬魚模式動(dòng)物為搭建快速、有效的毒性檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)提供了良好實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)，但要將斑馬魚毒性檢測(cè)方法作為標(biāo)準(zhǔn)方法應(yīng)用于食品安全性檢測(cè)與評(píng)價(jià),還有待進(jìn)一步完善和優(yōu)化[2]。本研究擬優(yōu)化試驗(yàn)用斑馬魚的基本條件、非水溶性和水中溶解度較低的受試物的處理要求和斑馬魚急性毒性試驗(yàn)條件，檢測(cè)和分析輔酶Q、低聚果糖、雙酚A對(duì)斑馬魚的毒性作用，探討優(yōu)化的斑馬魚急性毒性檢測(cè)方法在食品安全性檢測(cè)與評(píng)價(jià)中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚斑馬魚來(lái)源于南方醫(yī)科大學(xué)，斑馬魚平均體長(zhǎng)26.0±2mm，平均體重0.26±0.11g。

1.1.2 試劑二甲基亞砜(美國(guó)sigma)，輔酶Q(某生產(chǎn)廠家提供)，低聚果糖(某生產(chǎn)廠家提供),雙酚A (美國(guó)sigma)，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水(按照GB 13267-91來(lái)配制)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)用斑馬魚的基本條件試驗(yàn)魚種應(yīng)是斑馬擔(dān)尼魚(真骨魚總目，鯉科)，試驗(yàn)魚應(yīng)無(wú)明顯的疾病和肉眼可見(jiàn)的畸形，試驗(yàn)魚試驗(yàn)前兩周內(nèi)不應(yīng)對(duì)其做疾病處理，試驗(yàn)魚試驗(yàn)前應(yīng)在與試驗(yàn)時(shí)相同的環(huán)境條件下馴養(yǎng)3周，馴養(yǎng)期間死亡率不得超過(guò)10%，如果超過(guò)10%，則該批魚不得用作試驗(yàn)。試驗(yàn)魚試驗(yàn)前24h停止喂飼，試驗(yàn)魚宜選擇體長(zhǎng)30±5mm、體重0.3±0.1g健康且個(gè)體差異不大且同一魚群的斑馬魚[1，2]。

1.2.2 非水溶性和水中溶解度較低的受試物的處理要求試驗(yàn)當(dāng)天配制受試物試驗(yàn)溶液，水溶性受試物可溶于一定體積的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水、去離于水或蒸餾水中；水中溶解度較低受試物，可使用超聲波裝置助溶或在不破壞受試物的溫度下加熱助溶；非水溶性的受試物，可使用少量對(duì)魚低毒的有機(jī)溶劑(二甲基亞砜等)助溶后再使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水將其配置成溶液，但有機(jī)溶劑在試驗(yàn)溶液中的濃度不應(yīng)超過(guò)0.1mg／L，并應(yīng)同時(shí)進(jìn)行兩組對(duì)照試驗(yàn)，一組含有的溶劑為全部試驗(yàn)溶液中的最高濃度，另一組則不含溶劑或試驗(yàn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水[3，4]。

1.2.3 斑馬魚急性毒性試驗(yàn)條件試驗(yàn)魚缸一般選擇5L容積的玻璃魚缸，使用前應(yīng)清洗干凈并裝滿純凈水浸泡48h，使用前倒掉魚缸中的純凈水并用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水潤(rùn)洗后裝入4L新配制的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水(pH為7.4±0.2，溫度為23±1℃，硬度為250㎎/L左右),曝氣至溶解氧濃度達(dá)到空氣飽和值供試驗(yàn)用，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中溶解氧應(yīng)不少于4mg/L。實(shí)驗(yàn)時(shí)，注意保持魚缸每天光照與黑暗的時(shí)間比為16∶8，光照度1000 Lux，魚缸內(nèi)水溫為23±1℃，pH穩(wěn)定在7.4±0.2[5]。

1.2.4 受試物劑量選擇和試驗(yàn)溶液配制根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，輔酶Q設(shè)100、200、400、600、800、1000mg/L共6個(gè)劑量組和2個(gè)對(duì)照組(溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組)，輔酶Q先用二甲基亞砜助溶后再用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水按所設(shè)濃度分別配置1L試驗(yàn)溶液(5倍濃度)供試驗(yàn)用，溶劑對(duì)照組的試驗(yàn)溶液按二甲基亞砜的最高使用濃度配置，空白對(duì)照組的試驗(yàn)溶液直接使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水。低聚果糖設(shè)100、200、400、600、800、1000mg/L共6個(gè)劑量組和2個(gè)對(duì)照組(溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組)，低聚果糖先用少量蒸餾水溶解后再用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水按所設(shè)濃度分別配置1L試驗(yàn)溶液(5倍濃度)供試驗(yàn)用，溶劑對(duì)照組的試驗(yàn)溶液按蒸餾水的最高使用濃度配置，空白對(duì)照組的試驗(yàn)溶液直接使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水。雙酚A設(shè)1、2、4、6、8、10mg/L共6個(gè)劑量組和2個(gè)對(duì)照組(溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組)，雙酚A先用二甲基亞砜助溶后再用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水按所設(shè)濃度分別配置1L試驗(yàn)溶液(5倍濃度)供試驗(yàn)用，溶劑對(duì)照組的試驗(yàn)溶液按二甲基亞砜的最高使用濃度配置，空白對(duì)照組的試驗(yàn)溶液直接使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水。

1.2.5 斑馬魚急性毒性試驗(yàn)方法將受試物輔酶Q、低聚果糖、雙酚A配制好試驗(yàn)溶液(5倍濃度)后，實(shí)驗(yàn)時(shí)分別將各劑量組和對(duì)照組的試驗(yàn)溶液加入到已備好的5L魚缸中，并將1L試驗(yàn)溶液(5倍濃度)和魚缸中的4L標(biāo)準(zhǔn)溶液充分混勻。選擇個(gè)體差異不大的健康斑馬魚在每個(gè)5L魚缸中投入10條，整個(gè)試驗(yàn)期間不喂食，試驗(yàn)過(guò)程中分別觀察每個(gè)魚缸中斑馬魚的反應(yīng)情況，并記錄有異常反應(yīng)的斑馬魚的具體反應(yīng)情況。斑馬魚的中毒反應(yīng)表現(xiàn)為時(shí)而竄動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、游動(dòng)能力下降、身體沉底、失去平衡、側(cè)翻、身體彎曲、身體畸形、躺臥死亡等，如果斑馬魚沒(méi)有任何的生存跡象，如鰓的扇動(dòng)，碰觸魚后也無(wú)反應(yīng)，即可判斷該魚死亡，發(fā)現(xiàn)斑馬魚死亡時(shí)要及時(shí)撈出死亡個(gè)體，并記錄死亡時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)得到的各組死亡情況，統(tǒng)計(jì)各組死亡率。采用寇氏法計(jì)算受試物對(duì)斑馬魚的LC50，計(jì)算公式為lgLC50=Xm-i(∑p－0.5)，式中Xm為死亡組最大劑量的對(duì)數(shù)，i為相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)之差，p為各組某一時(shí)間點(diǎn)的死亡率，∑p為各組某一時(shí)間點(diǎn)的死亡率之和[5]。受試物對(duì)斑馬魚的LC50采用用48hLC50表示結(jié)果，并根據(jù)“GB/T 21281-2007危險(xiǎn)化學(xué)品魚類急性毒性分級(jí)試驗(yàn)方法”進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 輔酶Q對(duì)斑馬魚的毒性作用情況斑馬魚在劑量為100mg/L～1000mg/L的輔酶Q、溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組的試驗(yàn)溶液中飼養(yǎng)48h，未發(fā)現(xiàn)斑馬魚有任何毒性反應(yīng)，輔酶Q對(duì)斑馬魚的48hLC50為大于1000mg/L。

2.2 低聚果糖對(duì)斑馬魚的毒性作用情況斑馬魚在劑量為100mg/L～1000mg/L的低聚果糖、溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組的試驗(yàn)溶液中飼養(yǎng)48h，未發(fā)現(xiàn)斑馬魚有任何毒性反應(yīng)，低聚果糖對(duì)斑馬魚的48hLC50為大于1000mg/L。

2.3 雙酚A對(duì)斑馬魚的毒性作用情況斑馬魚在劑量為10mg/L的雙酚A試驗(yàn)溶液飼養(yǎng)3h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在劑量為8mg/L的雙酚A試驗(yàn)溶液飼養(yǎng)6h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在劑量為6mg/L的雙酚A試驗(yàn)溶液飼養(yǎng)12h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，斑馬魚的毒性反應(yīng)初期表現(xiàn)為游動(dòng)能力下降，反應(yīng)比較遲鈍等中毒癥狀，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)中毒魚出現(xiàn)失去平衡、側(cè)翻，并慢慢喪失運(yùn)動(dòng)能力，隨后出現(xiàn)身體彎曲、畸形，最后躺臥死亡。斑馬魚在劑量為1mg/L～4mg/L的雙酚A、溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組的試驗(yàn)溶液中飼養(yǎng)48h，未發(fā)現(xiàn)斑馬魚有任何毒性反應(yīng)。根據(jù)記錄的各組斑馬魚死亡情況，計(jì)算各組斑馬魚死亡率，采用寇氏法計(jì)算出雙酚A對(duì)斑馬魚的48hLC50為7.15mg/L。見(jiàn)圖1。

圖1 雙酚A對(duì)斑馬魚的毒性作用情況

3 討論

自20世紀(jì)70年代末，國(guó)外開始運(yùn)用斑馬魚進(jìn)行有毒化學(xué)物監(jiān)測(cè)方面的研究，研究的化學(xué)物包括鋅、鎘、硒、汞等重金屬以及苯酚、苯胺、環(huán)己胺等有機(jī)物[6]。近年來(lái)，斑馬魚模式動(dòng)物在國(guó)內(nèi)的江、河水體污染監(jiān)測(cè)和控制等方面的應(yīng)用逐漸受到研究機(jī)構(gòu)的重視，很多國(guó)內(nèi)研究者開展了激素、中藥、有毒化學(xué)品等對(duì)斑馬魚毒性影響方面的研究，分析了其在檢測(cè)判斷污染物的毒性類型及潛在危害程度方面的特有優(yōu)勢(shì)，這些研究也為斑馬魚模式動(dòng)物在多領(lǐng)域的拓展應(yīng)用提供了很好的研究基礎(chǔ)[7-9]。

人們一直以為日常生活環(huán)境中接觸的雙酚A濃度很低，不足以構(gòu)成對(duì)人體的危害，在民間、廠商、官方之間一直久拖未決進(jìn)行著“低劑量雙酚A有害還是安全”的爭(zhēng)論，但在“雙酚A奶瓶事件”發(fā)生后，世界各國(guó)都對(duì)雙酚A的毒性都極其重視，有研究表明[10-13]雙酚A具有一定的毒性和致畸性，可明顯增加動(dòng)物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌癥的發(fā)生。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示斑馬魚在劑量為10mg/ L的雙酚A試驗(yàn)溶液飼養(yǎng)3h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在劑量為8mg/L的雙酚A試驗(yàn)溶液飼養(yǎng)6h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在劑量為6mg/L的雙酚A試驗(yàn)溶液飼養(yǎng)12h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，但斑馬魚在劑量為1mg/L～4mg/L的雙酚A的試驗(yàn)溶液、溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組的試驗(yàn)溶液中飼養(yǎng)48h，未發(fā)現(xiàn)斑馬魚有任何毒性反應(yīng)。本研究結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道有較好的一致性[14，15]。

本研究通過(guò)完善和優(yōu)化試驗(yàn)用斑馬魚的基本條件、非水溶性和水中溶解度較低的受試物的處理要求和斑馬魚急性毒性試驗(yàn)條件，使優(yōu)化的斑馬魚急性毒性檢測(cè)方法能夠快速檢測(cè)不同類別的食品和食品污染物的急性毒性作用，使該檢測(cè)方法有了更廣的應(yīng)用范圍和更趨于標(biāo)準(zhǔn)化。本研究對(duì)推動(dòng)斑馬魚急性毒性檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)，對(duì)斑馬魚急性毒性檢測(cè)方法作為食品安全應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，該檢測(cè)方法在食品安全性檢測(cè)方面將有著廣泛的應(yīng)用前景。

[1]OECD.OECD guideline for the testing of chemicals fish embryotoxicity test with the zebrafish(B.Rerio)[M].Paris：OECD TG 212,1996∶26-76.

[2]鄭麗麗,吳端生.斑馬魚實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究及應(yīng)用[J].南華大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,36(2)∶249-251.

[3]譚蘋,肖少玉.空心蓮子草對(duì)斑馬魚的急性毒性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(8)∶4046-4048．

[4]舒斌,韋英杰,張陸勇,等.采用模式生物斑馬魚評(píng)價(jià)三種中藥成分的急性毒性[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,33(1)∶35-37.

[5]姜瑋,王新敏,唐于平,等.甘遂不同提取物對(duì)斑馬魚急性毒性的初步觀察[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(1)∶53-56.

[6]Teraoka H,Dong W,Hiraga T.Zebrafish as a novel experimental model for developmental toxicology[J].Congenit Anom(Kyoto), 2003,43(02)∶123-132.

[7]李麗君,劉振乾,徐國(guó)棟,等.工業(yè)廢水的魚類急性毒性效應(yīng)研究[J].生態(tài)科學(xué),2006,25(1)∶43-47.

[8]董武,魏強(qiáng),寺岡宏樹,等.二惡英誘發(fā)斑馬魚初期胚的循環(huán)系統(tǒng)障礙[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2002,10(2)∶69-72.

[9]王佑華;黎晌;楊彬睿，等.斑馬魚模型在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2012,25(1)∶1189-1194.

[10]陳以償,郝衛(wèi)東,尚蘭琴,等.圍生期雙酚A暴露對(duì)大鼠雌性子代生殖系統(tǒng)及雌激素受體表達(dá)的影響[J].癌變·畸變·突變,2010,22 (3)∶196-201.

[11]張帥帥,劉堰,劉樹深,等.不同終點(diǎn)檢測(cè)5種雙酚A類化合物對(duì)MCF-7的細(xì)胞毒性[J].環(huán)境科學(xué),2012,33(11)∶3935-3940.

[12]李君君,李力軍,徐惠誠(chéng),等.雙酚A的健康影響以及各國(guó)對(duì)其在塑料制品中的限量要求[J].環(huán)境與健康雜志,2012,29(4)∶379-382. [13]楊淋清.低劑量雙酚A與乳腺癌關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國(guó)公共生, 2010,26(12)∶1557-1559.

[14]夏勇,傅劍云,陳苘,等.雙酚A對(duì)斑馬魚急性毒性及P53基因誘變性影響[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2012,28(3)∶354-356．

[15]端正花,朱琳,王平,等.雙酚A對(duì)斑馬魚不同發(fā)育階段的毒性及機(jī)理[J].環(huán)境化學(xué),2007,26(4)∶491-494.

Optimization and application on the toxicity test method of zebrafish

LI Zhi，HUANG Junming.Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou 511430,China

Objective By optimizing the acute toxicity test method of zebrafish,the toxic effect of coenzyme Q,fructooligosaccharides(FOS)and bisphenol A on zebrafish were detected and analyzed,and to explore the application prospect of the method in food safety test and evaluation.Methods The basic state of zebrafish and the acute toxicity test conditions were optimized.Zebrafish were exposured to the solution containing different concentrations of coenzyme Q,FOS and bisphenol A for 48h,the zebrafish toxicity and mortality rate were observed,the toxic effect were detected.Results When zebrafish were fed in the test solution containing 100～1000mg/L coenzyme Q for 48h,no toxicity was found,the LC50of coenzyme Q in 48h was greater than 1000mg/L.While zebrafish were fed in the test solution containing 100～1000mg/L FOS for 48h,no toxicity was found,the LC50of FOS in 48h was greater than 1000mg/L.After zebrafish were fed in the test solution containing 10mg/L bisphenol A for 3h,containing 8mg/L bisphenol A for 6h，containing 6mg/L bisphenol A for 12h，the toxic reaction could be detected,the LC50of bisphenol A in 48h was 7.15mg/L.Conclusion This study showed that the optimized acute toxicity test method of zebrafish can be used as rapid detection method for the acute toxicity of food and food contaminants,and has a wide range of applications in the safety test and evaluation of food.

Zebrafish;Acute toxicity;Bisphenol A;Optimization

R155.5+5

A

1674-1129(2014)06-0658-03

2014-09-02；

2014-10-15)

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目(編號(hào)：A2010058)

李志，男,1975年出生,副主任醫(yī)師,本科,研究方向∶食品衛(wèi)生。