張華，鐘白云，張秋煥

(1、益陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南益陽413000；2、中南大學(xué)湘雅醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長沙410008)

·論著·

HCCR mRNA在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)及臨床意義

張華1，鐘白云2，張秋煥2

(1、益陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南益陽413000；2、中南大學(xué)湘雅醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長沙410008)

目的探討人宮頸癌基因(human cervical cancer oncogene，HCCR)mRNA在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)患者中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用RT-PCR檢測PHC癌組織、癌旁肝組織和肝硬化組織及各組外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中的HCCR mRNA表達(dá)水平，并進(jìn)行分析。結(jié)果HCCR mRNA在PHC組織中的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為0.83±0.10，癌旁肝組織中的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為0.12±0.07，肝硬化組織中的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為0.57±0.12，三組均數(shù)間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PBMC中，肝癌患者HCCR mRNA的表達(dá)強(qiáng)度為0.55±0.06，肝硬化患者HCCR mRNA的表達(dá)強(qiáng)度為0.34±0.04，而正常人未檢測出，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論P(yáng)HC和肝硬化患者的組織和PBMC中HCCR表達(dá)明顯增高，HCCR基因可能參與了PHC的發(fā)生與發(fā)展，其與PHC的惡變演進(jìn)有一定的相關(guān)性。

人宮頸癌基因；原發(fā)性肝細(xì)胞癌；肝硬化；mRNA

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)是常見的消化道腫瘤之一，其一般起病隱匿，早期癥狀不明顯，確診時(shí)多屬晚期，治療效果差，預(yù)后惡劣，因此開展早期檢測、診斷和治療，對(duì)PHC患者尤為重要[1]。有研究表明，由Ko J等用差異RT-PCR法從宮頸癌癌組織篩選得到的差異表達(dá)基因人宮頸癌基因(Human cervical cancer oncogene，HCCR)與PHC關(guān)系密切，可能在PHC早期發(fā)生中起“主導(dǎo)”作用[2，3]。筆者在本研究的前期工作中應(yīng)用ELISA對(duì)HBV相關(guān)性肝臟疾病患者的血清HCCR水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)HCCR隨著HBsAg的升高而升高。本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)和瓊脂糖凝膠電泳分析組織和外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中HCCR的水平，旨在探討HCCR基因是否參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展，及其與PHC的惡變演進(jìn)是否有一定的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象40份肝細(xì)胞癌標(biāo)本來自益陽市中心醫(yī)院2013年1月至2014年3月住院病人手術(shù)切除標(biāo)本，男24例,女16例,平均年齡43±12歲，均經(jīng)病理檢查證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌(PHC)，所有標(biāo)本手術(shù)前未經(jīng)過放療、化療、微波刀、介入等針對(duì)腫瘤的任何治療，有手術(shù)前后完整的病案資料；每例病人分別取腫瘤組織和遠(yuǎn)端癌旁組織(距腫瘤邊2～5cm，病理學(xué)證實(shí)為正常組織)，組織均凍于液氮備用。40例肝硬化標(biāo)本來自肝穿刺活檢標(biāo)本，經(jīng)病理檢查證實(shí)為肝硬化，其中男22例，女18例，平均年齡40±15歲；對(duì)照組40例來自肝功能正常及其它肝炎病毒標(biāo)志物均為陰性的本院健康體檢者。所有研究對(duì)象排除腦、肺、腎、胰等器官疾病及女性宮頸癌疾病。

1.2 主要試劑Trizol RNA提取試劑盒系A(chǔ)MV TaKaRa生物公司產(chǎn)品，F(xiàn)icoll分離液、Hank’s液系上海研卉生物科技有限公司產(chǎn)品，Tris堿、逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、5×定量PCR Buffer、dNTPs、引物、探針、TaqDNA聚合酶、5×逆轉(zhuǎn)錄Buffer、Rnase抑制劑購自北京達(dá)安基因股份有限公司，氯仿、異丙醇、溴化乙錠、二甲苯青FF、DEPC水、瓊脂糖購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，100bp DNA Marker購自百川開泰生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PBMC中提取總RNA采用Ficoll分離液得到其PBMC，-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。然后參照Trizol RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.2 組織中RNA的提取將存于液氮中的組織取出50mg，迅速移于預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，成粉末狀后，同樣參照Trizol RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。最后用移液管加入DEPC水，使RNA完全溶解。

1.3.3 總RNA純度、濃度及完整性測定在200μl PCR管中加入1.0μl RNA原液，加DEPC水至100μl，移液槍反復(fù)吹打混勻。采用紫外分光光度計(jì)測定A260、A280值，計(jì)算A260/A280比值。比值≥1.8滿足要求。RNA原液濃度=A260×稀釋倍數(shù)×100(ng/ μl)。電泳檢測結(jié)果出現(xiàn)明顯的5S、18S和28S的三個(gè)條帶者視為RNA結(jié)構(gòu)完整(圖1)，符合RT-PCR實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 RNA凝膠電泳(M:Marker)

1.3.4 引物設(shè)計(jì)、合成用軟件Premier5.0設(shè)計(jì)引物，HCCR序列如下，上游S1：5＇ACCCC^AAACAACAAACTG3＇；下游S2：5＇ATGGTTCATlll2AGCGCCTr-3＇，相應(yīng)的RT-PCR產(chǎn)物大小為579bp。內(nèi)參設(shè)為GAPDH：上游S1∶5＇-GGAGCGAGATCCCTCCAAAA-3＇；下游S2：5＇GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3＇，產(chǎn)物大小為197bp，引物由Invintrogen公司合成。

1.3.5 cDNA的合成25μl逆轉(zhuǎn)錄體系：根據(jù)A260算出RNA的濃度，取2.0μgRNA，隨機(jī)引物2.0μl，5×RT緩沖液4.0μl，10 U/μl Rnase抑制劑1.0μl，25 mmol/L Mg2+l.0μl，10mmol/L dNTP 2.0μl，100 U/μl M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1.0μl，DEPC水補(bǔ)足體系，37℃水浴60 min，94℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，4℃微離心，獲取的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)(RT-PCR)反應(yīng)體系為25μl，包括cDNA 1.0μl，Taq緩沖液2.5μl，10mmol/l dNTP1.0μl,25 mmol/L Mg2+1.5μl，2.5U/ μl Taq酶0.4μl，10μmol/L待測HCCR上、下游引物及GAPDH各1.0μl，用DEPC水補(bǔ)至25μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，然后95℃變性30s，60℃退火20s，72℃延伸30s，40次循環(huán)結(jié)束。每一樣本的檢測均做3個(gè)平行管以保證其結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3.7 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物取10μl PCR產(chǎn)物，加入2μl上樣緩沖液，混勻后加樣，同時(shí)滴加5μl DNA Marker，在80V電壓下電泳(根據(jù)示蹤劑溴酚藍(lán)的遷移距離)。在凝膠電泳成像系統(tǒng)(Image master VDS)下觀察、照相。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量資料采用x±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織、肝硬化組織和正常肝組織的HCCR基因表達(dá)的比較在凝膠電泳成像系統(tǒng)(Image master VDS)下拍照，通過Image master VDS分析軟件對(duì)照片進(jìn)行去噪、增強(qiáng)等處理，利用已知濃度內(nèi)參GAPDH進(jìn)行定量分析，如圖2所示。分析各組的HCCR mRNA表達(dá)水平，比較三組HCCR mRNA表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌組織中的HCCR mRNA表達(dá)水平明顯高于肝硬化及癌旁肝組織(P＜0.05)，其增高次序?yàn)椋喊┡愿谓M織＜肝硬化＜肝細(xì)胞癌，如表1所示。

2.2 PHC、肝硬化患者和正常人PBMC中HCCR基因表達(dá)的比較PHC與肝硬化患者PBMC的HCCR基因表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.00)，而正常人PBMC的HCCR mRNA無表達(dá)，三者相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，如圖3，表2所示。

圖2 肝細(xì)胞癌組織、肝硬化組織和癌旁正常肝組織的HCCR mRNA的含量

表1 肝細(xì)胞癌、肝硬化和癌旁正常肝組織中HCCR mRNA的表達(dá)情況

圖3 肝細(xì)胞癌患者、肝硬化患者和正常人PBMC中HCCR mRNA的含量

表2 PHC、肝硬化患者和正常人PBMC中HCCR mRNA的表達(dá)情況

3 討論

人宮頸癌基因(human cervical cancer oncogene，HCCR)是近年發(fā)現(xiàn)的與人類多種腫瘤有關(guān)的基因，系由Ko J等用差異RT-PCR法從宮頸癌癌組織篩選得到的差異表達(dá)基因，其定位于人的染色體的12q，編碼HCCR-1和HCCR-2兩種單跨膜蛋白，分子量分別為42kDa和36kDa[2]。HCCR不僅在宮頸癌組織中表達(dá)，而且在許多其他腫瘤(如乳腺、腎、淋巴、胃、結(jié)腸、卵巢等)中也可見其呈過量表達(dá)，尤其在腫瘤早期就可檢測出HCCR過量表達(dá)[3]。

本研究結(jié)果顯示PHC患者的肝細(xì)胞癌組織中的HCCR mRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為0.83±0.10，而其對(duì)應(yīng)的癌旁正常肝組織為0.12±0.07，肝硬化組織HCCR mRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為0.57±0.12，三者相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=539.34，P＜0.05)。其增高次序?yàn)椋喊┡哉８谓M織＜肝硬化＜肝細(xì)胞癌，隨著臨床表現(xiàn)逐步加重逐步升高(P＜0.05)。通過對(duì)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行分析，HCCR mRNA在PHC組織中的含量明顯高于肝硬化及遠(yuǎn)端癌旁正常肝組織，提示HCCR可用于評(píng)價(jià)和監(jiān)測從肝硬化到肝細(xì)胞癌的進(jìn)展過程，HCCR的異常表達(dá)與PHC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究使用HCCR的反義核酸轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞中的HCCR的表達(dá)受抑制，細(xì)胞停滯于G1期，通過抑制細(xì)胞的增殖從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示癌基因HCCR可能在肝細(xì)胞癌的病變?cè)缙诰烷_始起作用，與PHC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。本研究結(jié)果與上述觀點(diǎn)一致。但HCCR異常表達(dá)參與PHC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有待進(jìn)一步研究。目前認(rèn)為HCCR參與PHC早期發(fā)生的機(jī)制可能有：(1)被稱為“基因組衛(wèi)士”的腫瘤抑制基因p53，在機(jī)體組織細(xì)胞的生長、發(fā)育與分化等過程中起重要作用，p53編碼序列發(fā)生改變是人類腫瘤中普遍的基因改變[5,6]。p53基因是許多惡性腫瘤十分常見的共同基因損傷靶位，它的結(jié)構(gòu)改變與表達(dá)異?？赡苁沁@些腫瘤發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)包括pHC在內(nèi)的人類惡性腫瘤中至少有50%發(fā)生了p53基因改變，失去了有功能的p53蛋白，野生型p53基因?yàn)橐职┗颍蛔兓蚱渌驅(qū)е缕涔δ苁Щ钍筽53基因失去抑癌基因作用，這是研究癌基因與抑癌基因相互作用導(dǎo)致腫瘤發(fā)生機(jī)制的熱點(diǎn)之一[7,8]。有研究發(fā)現(xiàn)HCCR是腫瘤抑制因子p53的調(diào)節(jié)因子，通過誘導(dǎo)p53翻譯后修飾，抑制泛素依賴性蛋白酶體途徑對(duì)p53的降解、引起p53轉(zhuǎn)錄物活性負(fù)性調(diào)節(jié)等機(jī)制使p53功能發(fā)生缺陷，從而抑制p53功能來促進(jìn)癌變[9]。預(yù)示其可以作為PHC重要的早期診斷標(biāo)記物以及基因治療的作用靶點(diǎn)，因此，深入研究HCCR在肝細(xì)胞癌早期診斷中的價(jià)值以及其生物學(xué)功能具有重要的臨床意義。(2)HCCR的致癌作用是通過磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)途徑實(shí)現(xiàn)的，PI3K的過量表達(dá)能激活HCCR的啟動(dòng)子，即PI3K/Akt途徑活化可以促進(jìn)HCCR表達(dá)，HBV編碼HBx可以通過PI3K/Akt途徑上調(diào)HCCR的表達(dá)，傳遞細(xì)胞存活的信號(hào)，說明在PHC發(fā)生和發(fā)展過程中，HCCR和HBV可能起著協(xié)同作用[10-12]。HCCR在PHC組織中高表達(dá)，而在正常肝組織中低表達(dá)或不表達(dá)，故可以將HCCR作為診斷PHC的一種新的標(biāo)志物，用于PHC的早期診斷。本研究還發(fā)現(xiàn)PHC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中HCCR mRNA水平高于肝硬化患者，而正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞HCCR mRNA無表達(dá)，這意味著血清HCCR蛋白可作為PHC診斷及鑒別診斷的生物學(xué)標(biāo)志物?，F(xiàn)已制備了HCCR的多克隆抗體，建立了檢測血清HCCR水平的間接ELISA方法，發(fā)現(xiàn)PHC患者血清中HCCR水平顯著高于脂肪肝(非酒精性)、肝硬化、慢性活動(dòng)性肝炎等患者，提示血液中HCCR mRNA的水平高低可能與肝病患者的病情發(fā)展有關(guān)，可用于診斷PHC，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，HCCR在肝細(xì)胞癌腫瘤組織PBMC中有較強(qiáng)表達(dá)，提示HCCR可能在PHC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，HCCR有望成為PHC病情發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后評(píng)估的重要標(biāo)志物，在診斷早期PHC及小肝細(xì)胞癌等方面具有很好的應(yīng)用前景。

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Relationship between HCCR mRNA and primary hepatocellular carcinoma

ZHANG Hua,ZHONG Baiyun,ZHANG Qiuhuan.Department of Clinical Laboratory,the Central Hospital of Yiyang City,Yiyang Hunan 413000,China

Objective To detect the expression level of HCCR mRNA in primary hepatocellular carcinoma(PHC)and explore its clinical significance.Methods Reverse transcription polymerase chain reaction was used to detect the expression of HCCR mRNA in PHC tissues,surrounding non-tumor tissues,hepatocirrhosis tissues and peripheral blood mononuclear cells.Results The relative expression level of HCCR mRNA in PHC tissues was 0.83±0.10,and which in surrounding non-tumor tissues and the hepatocirrhosis tissues were 0.12±0.07 and 0.57±0.12,respectively.The differences in the three groups had statistical significance (P＜0.05).The relative mRNA level of HCCR in the PBMC of PHC patients were 0.55±0.06 and which in the hepatocirrhosis patients were 0.34±0.04,while HCCR expression in the normal ones could not detected.The differences had statistical significance (P＜0.05).Conclusion The mRNA levels of HCCR in PHC tissues,hepatocirrhosis tissues and their PBMC are up-regulated significantly,which suggests that HCCR maybe involved in the occurrence and development of PHC,and maybe related to the malignant change of PHC.

Human cervical cancer oncogene;Primary hepatocellular carcinoma;Hepatocirrhosis;mRNA

R735.7,R446.62

A

1674-1129(2014)06-0654-04DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.002

2014-09-02；

2014-10-08)

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO.12JJ3089)

張華，男，出生于1981年，碩士，主管檢驗(yàn)師，主要從事分子生物和生物化學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究。