林迪，孫長貴

(解放軍第117醫(yī)院檢驗科南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)檢驗質(zhì)控中心，浙江杭州310013)

·述評·

登革病毒感染及其實驗室檢查

林迪，孫長貴

(解放軍第117醫(yī)院檢驗科南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)檢驗質(zhì)控中心，浙江杭州310013)

登革熱是登革病毒引起的一種急性傳染病，是世界上蔓延速度最快的蟲媒病毒感染疾病，WHO根據(jù)臨床表現(xiàn)把登革熱分為典型登革熱(Dengue fever，DF)、登革出血熱(Dengue haemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome，DSS)三型。登革熱廣泛流行于全球熱帶及亞熱帶地區(qū)，嚴重威脅全球25億人口的健康，每年有超過5000萬人感染登革熱。今年6月份以來，我國廣東省登革熱疫情呈暴發(fā)式增長，截至2014年10月10日零時，廣東省衛(wèi)計委最新通報顯示全省共有20個地級市報告登革熱臨床診斷和實驗室確診病例27593例，較去年同期上升2610.51%，引起國人廣泛關(guān)注。本文就該病毒的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性、流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、診斷與鑒別診斷和實驗室檢查等作簡要綜述。

登革熱病毒；蟲媒；流行病學(xué)；感染；實驗室檢查

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.001

登革熱是由登革病毒引起的急性傳染病，該病毒主要通過埃及伊蚊或白紋伊蚊叮咬傳播，除了人類埃及斑蚊外，登革病毒的自然宿主尚有低等靈長類(黑猩猩、長臂猿、彌猴)，1931年Simmons等學(xué)者首先證實登革病毒可經(jīng)由猴子傳播猴子或經(jīng)由猴子傳播給人，但相對很少有能證明在人類之間傳播的相關(guān)病毒動力學(xué)和模式研究[1-3]。登革病毒感染所致疾病包括從較輕的登革熱(DF)到嚴重致死性的登革出血熱(DHF)以及登革休克綜合癥(DSS)。WHO估計每年全球有5000萬例登革熱和幾十萬例登革出血熱[4]。本文就登革病毒相關(guān)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性、發(fā)病機制、流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、診斷與鑒別診斷和實驗室檢查等作簡要綜述。

1 登革病毒的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性

登革病毒屬B組蟲媒病毒，黃病毒科黃病毒屬。病毒顆粒呈啞鈴狀(700nm×20～40nm)、棒狀或球形(直徑45～55nm)，為單股正鏈RNA病毒，RNA分子量4.103kD。登革病毒核心為RNA與蛋白質(zhì)組成的20面立體對稱的病毒顆粒，外層為兩種糖蛋白組成的包膜，包膜含有型和群特異性抗原，用中和試驗可鑒定其型別。病毒基因編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白，3個結(jié)構(gòu)蛋白為：E蛋白(包膜蛋白)、C蛋白(核心殼蛋白)和M蛋白(膜蛋白)，E蛋白含有中和抗原和病毒的種、屬、型等特異性表位，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體、血凝抑制抗體，此外還可能引起抗體依賴的增強感染作用(ADE)，C蛋白可能在蛋白質(zhì)和RNA的相互作用中發(fā)揮作用，M蛋白與病毒感染能力的強弱有關(guān)；7個非結(jié)構(gòu)蛋白為：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5[5]。登革病毒按照血清學(xué)方法可分為4種血清型：DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4，4種血清型均可感染人。登革病毒對熱敏感，56℃30min可滅活，但在4℃條件下其感染性可保持數(shù)周之久。超聲波、紫外線、0.05%甲醛溶液、乳酸、高錳酸鉀、龍膽紫等均可滅活病毒。病毒在pH 7～9時最為穩(wěn)定，在-70℃或冷凍干燥狀態(tài)下可長期存活[6]。

2 發(fā)病機制

登革病毒感染的發(fā)病機理迄今尚未完全闡明，目前關(guān)于登革病毒感染的假說主要有以下幾種。

2.1 病毒細胞和組織嗜性

2.1.1 細胞的免疫系統(tǒng)蚊蟲叮咬人類后，登革病毒通過表皮和真皮進入血液，感染未成熟的朗格漢斯細胞[表皮樹突狀細胞(DC)]和角化細胞[7，8]，感染細胞然后遷移至淋巴結(jié)，單核和巨噬細胞聚集的淋巴結(jié)成為感染的靶目標(biāo)，隨后感染擴散并通過淋巴系統(tǒng)傳播[9]。

2.1.2 器官損傷Martina BE等人通過相關(guān)文獻統(tǒng)計了160例登革熱感染的致命病例，并對其尸檢結(jié)果進行回顧性分析發(fā)現(xiàn)，登革病毒存在于皮膚、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、骨髓、肺臟、胸腺和大腦[9]，廣州市第八人民醫(yī)院張復(fù)春等研究發(fā)現(xiàn)，大部分登革熱患者同時合并有肝損害，患者中超過2/3有肝功能異常，10.7%及11.8%患者ALT與AST水平升高5倍以上[10]。

2.1.3 內(nèi)皮細胞(EC)EC是否為登革病毒的嗜性細胞還存在爭議，但是一些研究顯示，血管損傷或功能障礙是DHF/DSS的主要發(fā)病機制，DHF/ DSS最主要的臨床表現(xiàn)是廣泛的毛細血管通透性增加而引起的大量血漿滲漏和出血[11]。

2.2 病毒毒力有研究人員認為DHF/DSS的發(fā)生是受一種毒力更強的登革病毒株的感染。登革病毒作為一個正鏈RNA病毒，缺乏精確的復(fù)制校正系統(tǒng)，在傳播過程中核苷酸的變化會導(dǎo)致病毒毒力的變化，從而產(chǎn)生毒力更強的病毒株[12]。

2.3 補體系統(tǒng)的激活登革病毒NS l蛋白可以表達在感染細胞的表面，是登革病毒感染體液免疫主要靶分子[13]。NSl可誘導(dǎo)抗NS1抗體產(chǎn)生，這種抗NS1抗體可通過分子模擬機制與病毒感染宿主的血管內(nèi)皮細胞和血小板非特異性結(jié)合，有效激活補體系統(tǒng)，生成大量毒性補體成分和攻膜復(fù)合體，直接和(或)間接作用于血管內(nèi)皮細胞[14]。

2.4 宿主的遺傳因素[9]與DHF/DSS相關(guān)的非HLA和HLA遺傳因素有：TNF-α、維生素D受體、FcrIIa受體、CTLA-4、TGF-β、甘露糖凝集素2 (MBL2)、抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白和人類血小板抗原基因的多態(tài)性；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)缺乏；HLAⅠ類等位基因A*01、A*0207、A*24、B*07、B*46、B*5；HLAⅡ類等位基因DQ*1、DR*1、DR*4。

2.5 抗體依賴性感染增強(ADE)血清學(xué)研究證實，登革病毒表面存在群特異性決定簇和型特異性決定簇，群特異性決定簇產(chǎn)生的抗體對登革病毒感染有較強的增強作用，稱增強性抗體；型特異性決定簇產(chǎn)生的抗體具有較強的中和作用，稱中和抗體，能中和同一型登革病毒的再感染，對異型病毒也有一定中和能力。當(dāng)機體二次感染不同型登革病毒時，如血清中增強性抗體活性弱，而中和抗體活性強，足以中和入侵病毒，則病毒血癥迅速被消除，患者可不發(fā)??；反之，體內(nèi)增強性抗體活性強，后者與病毒結(jié)合為免疫復(fù)合物，通過單核細胞或巨噬細胞膜上的Fc受體，促進病毒在這些細胞中復(fù)制，出現(xiàn)ADE效應(yīng)，導(dǎo)致患者臨床癥狀加重。

2.6 交叉反應(yīng)性T細胞反應(yīng)雖然記憶T細胞交叉反應(yīng)可以提供一定的保護性免疫，但同時它們也可引起顯著的免疫病理學(xué)反應(yīng)[15]。CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)具有血清型交叉反應(yīng)性，能溶解被所有4種血清型病毒抗原刺激或感染的細胞，可能參與病毒再次感染期間的免疫病理損傷。

2.7 細胞因子及可溶性因子風(fēng)暴高病毒載量和大量非保護T細胞的激活會引起炎性細胞因子、可溶性因子及其他介質(zhì)“風(fēng)暴”，這些物質(zhì)的過量釋放可激活補體系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)，使血管通透性增加，從而導(dǎo)致以血漿滲漏為主要特征的DHF/ DSS[16]。多項研究也證明了這個觀點，研究人員發(fā)現(xiàn)嚴重登革熱感染期患者血漿中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-13、IL-18、TGF-1β、TNF-α及IFN-γ的含量顯著提高，尤其是DSS[17-20]。其它介質(zhì)和可溶性因子包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、巨噬細胞移動抑制因子、促血小板生成素、可溶性血管細胞黏附分子1 (VCAM-1)、可溶性ICAM-1、血管性血友病因子抗原、血栓調(diào)節(jié)蛋白、E-選擇素、組織因子(TF)、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)和組織纖溶酶原激活物[21-26]。

3 流行病學(xué)

登革熱流行于全球熱帶及亞熱帶地區(qū)，尤其是在東南亞、太平洋島嶼和加勒比海等100多個國家和地區(qū)，已成為熱帶及亞熱帶地區(qū)非常嚴重的公共衛(wèi)生問題[27]。在我國，1978年廣東佛山首先爆發(fā)流行，以后在海南、廣東、廣西、福建、臺灣、香港及澳門等地均有小規(guī)模流行。近年來，全球登革病毒流行存在血清學(xué)漂移。我國登革病毒四種血清型均曾流行過，1995年以來，登革病毒1型是廣東登革熱流行的主要優(yōu)勢株，但是近年發(fā)生了登革病毒2、3、4型感染本土病例流行[28]。登革熱主要發(fā)生在夏秋季，居家待業(yè)和離退休人員較多。2014年6月以來廣東爆發(fā)的登革熱疫情據(jù)廣東省衛(wèi)計委最新通報顯示，截至2014年10月10日零時，全省共有20個地級市累計報告登革熱病例27593例，較去年同期(1018例)上升2610.51%。病例分布為：廣州(23484例)、佛山(2337例)、中山(392例)、江門(333例)、珠海(235例)、東莞(143例)、肇慶(125例)、深圳(122例)、陽江(104例)、湛江(97例)、清遠(67例)、汕頭(51例)、茂名(27例)、揭陽(27例)、潮州(18例)、河源(11例)、惠州(8例)、云浮(5例)、汕尾(4例)、韶關(guān)(3例)。累計報告死亡病例6例，其中廣州5例，佛山1例。

3.1 傳染源登革熱患者、隱性感染者和登革病毒感染的非人靈長類動物以及帶毒的媒介伊蚊。

3.2 傳播途徑主要通過伊蚊叮咬傳播。傳播媒介主要為埃及伊蚊和白紋伊蚊。

3.3 高危人群二次感染患者；伴有糖尿病、高血壓、冠心病、肝硬化、消化性潰瘍、哮喘、慢阻肺、慢性腎功能不全等基礎(chǔ)疾病者；老人或嬰幼兒；肥胖或嚴重營養(yǎng)不良者；孕婦。

4 臨床表現(xiàn)和病理特點[6,29]

登革熱的潛伏期一般為3～15d，多數(shù)5～8d。登革病毒感染可表現(xiàn)為無癥狀隱性感染、非重癥感染及重癥感染等。典型的登革熱病程分為三期，即急性發(fā)熱期、極期和恢復(fù)期。根據(jù)臨床表現(xiàn)嚴重程度，分為登革熱(DF)、登革出血熱(DHF)、登革休克綜合征(DSS)三個臨床型。

4.1 急性發(fā)熱期患者通常急性起病，首發(fā)癥狀為發(fā)熱，可伴畏寒，24h內(nèi)體溫可達40℃。部分病例發(fā)熱3～5d后體溫降至正常，1～3d后再度上升，稱為雙峰熱型。發(fā)熱時可伴頭痛，全身肌肉、骨骼和關(guān)節(jié)疼痛，明顯乏力，并可出現(xiàn)惡心，嘔吐，腹痛，腹瀉等胃腸道癥狀。急性發(fā)熱期一般持續(xù)2～7d。于病程第3～6d在顏面四肢出現(xiàn)充血性皮疹或點狀出血疹。典型皮疹為見于四肢的針尖樣出血點及“皮島”樣表現(xiàn)等?？沙霈F(xiàn)不同程度的出血現(xiàn)象，如皮下出血、注射部位瘀點瘀斑、牙齦出血、鼻衄及束臂試驗陽性等。

4.2 極期部分患者高熱持續(xù)不緩解，或退熱后病情加重，可因毛細血管通透性增加導(dǎo)致明顯的血漿滲漏，嚴重者可發(fā)生休克及其他重要臟器損傷等。極期通常出現(xiàn)在疾病的第3～8d。出現(xiàn)腹部劇痛、持續(xù)嘔吐等重癥預(yù)警指征往往提示極期的開始。在血漿滲漏發(fā)生前，患者常常表現(xiàn)為進行性白細胞減少以及血小板計數(shù)迅速降低。不同患者血漿滲漏的程度差別很大，如球結(jié)膜水腫、心包積液、胸腔積液和腹水等。紅細胞比容(HCT)升高的幅度常常反映血漿滲漏的嚴重程度。如果血漿滲漏造成血漿容量嚴重缺乏，患者可發(fā)生休克。長時間休克患者可發(fā)生代謝性酸中毒、多器官功能障礙和彌散性血管內(nèi)凝血。少數(shù)患者沒有明顯的血漿滲漏表現(xiàn)，但仍可出現(xiàn)嚴重出血如皮下血腫、消化道大出血、陰道大出血、顱內(nèi)出血、咯血、肉眼血尿等；患者還可出現(xiàn)腦炎或腦病表現(xiàn)(如劇烈頭痛、嗜睡、煩躁、譫妄、抽搐、昏迷、頸強直等)，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，急性心肌炎，急性肝衰竭，急性腎功能衰竭等。

4.3 恢復(fù)期極期后的2～3d，患者病情好轉(zhuǎn)，胃腸道癥狀減輕，進入恢復(fù)期。部分患者可見針尖樣出血點，下肢多見，可有皮膚瘙癢。白細胞計數(shù)開始上升，血小板計數(shù)逐漸恢復(fù)。

5 診斷與鑒別診斷[6,29]

5.1 登革熱診斷根據(jù)流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)及實驗室檢查結(jié)果，可做出登革熱的診斷。在流行病學(xué)史不詳?shù)那闆r下，根據(jù)臨床表現(xiàn)、輔助檢查和實驗室檢測結(jié)果做出診斷。

5.1.1 疑似病例符合登革熱臨床表現(xiàn)，有流行病學(xué)史(發(fā)病前15d內(nèi)到過登革熱流行區(qū)，或居住地有登革熱病例發(fā)生)，或有白細胞和血小板減少者。

5.1.2 臨床診斷病例符合登革熱臨床表現(xiàn)，有流行病學(xué)史，并有白細胞、血小板同時減少，單份血清登革病毒特異性IgM抗體陽性。

5.1.3 確診病例疑似或臨床診斷病例，急性期血清檢測出NS1抗原或病毒核酸，或分離出登革病毒或恢復(fù)期血清特異性IgG抗體陽轉(zhuǎn)或滴度呈4倍以上升高。

5.2 重癥登革熱的診斷有下列情況之一者：(1)嚴重出血包括皮下血腫、嘔血、黑便、陰道流血、肉眼血尿、顱內(nèi)出血等；(2)休克；(3)重要臟器功能障礙或衰竭：肝臟損傷(ALT和/或AST＞1000IU/L)、ARDS、急性心功能衰竭、急性腎功能衰竭、腦病(腦炎、腦膜腦炎)等。

5.3 鑒別診斷登革熱的臨床表現(xiàn)多樣，注意與下列疾病相鑒別。與發(fā)熱伴出血疾病如基孔肯雅熱、腎綜合征出血熱、發(fā)熱伴血小板減少綜合征等鑒別；與發(fā)熱伴皮疹疾病如麻疹、蕁麻疹、猩紅熱、流腦、斑疹傷寒、恙蟲病等鑒別；有腦病表現(xiàn)的病例需與其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染相鑒別；白細胞及血小板減低明顯者，需與血液系統(tǒng)疾病鑒別。

6 實驗室檢查[6,29]

6.1 一般檢查

6.1.1 血常規(guī)白細胞總數(shù)減少，多數(shù)病例早期開始下降，第4～5d降至最低點，白細胞分類計數(shù)以中性粒細胞下降為主。多數(shù)病例有血小板減少，最低可降至10×109/L以下。

6.1.2 尿常規(guī)可見少量蛋白、紅細胞等，可有管型出現(xiàn)。

6.1.3 血生化檢查超過半數(shù)的患者轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶升高，部分患者心肌酶、尿素氮和肌酐升高等。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)呈輕中度升高，少數(shù)患者總膽紅素升高，血清白蛋白降低。部分患者可出現(xiàn)低鉀血癥等電解質(zhì)紊亂；出凝血功能檢查可見纖維蛋白原減少，凝血酶原時間和部分凝血活酶時間延長，重癥病例的凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ減少。

6.2 病原學(xué)及相關(guān)檢查

6.2.1 病毒抗原檢測NS1是登革熱病毒感染的主要標(biāo)志性抗原，登革病毒NS1蛋白在登革熱病人剛開始發(fā)熱直至臨床期結(jié)束時都可以被檢測，甚至在登革病毒IgM抗體尚不能被檢出的情況下，登革病毒NS1蛋白就可以在血清、尿液和腦脊液中被檢出，因此，登革病毒NS1蛋白的檢測在登革熱的早期診斷中具有重要意義，其局限性在于敏感性較低。

6.2.2 血清學(xué)檢測初次感染患者，發(fā)病后3～5d可檢出IgM抗體，發(fā)病2周后達到高峰，可維持2～3月；發(fā)病1周后可檢出IgG抗體，IgG抗體可維持數(shù)年甚至終生；發(fā)病1周內(nèi)，在患者血清中檢出高水平特異性IgG抗體提示二次感染，也可結(jié)合捕獲法檢測的IgM/IgG抗體比值進行綜合判斷。

6.2.3 病毒分離登革病毒可從急性期病人血清、血漿、血細胞層或尸解臟器分離到，病毒分離培養(yǎng)是檢測登革病毒感染的金標(biāo)準，能夠?qū)毙云跇颖具M行確認，并能夠區(qū)分血清型。登革熱病毒的分離培養(yǎng)可通過活蚊、細胞或動物進行?；钗?巨蚊和伊蚊)分離是目前最敏感的登革病毒分離方法，但對接種技術(shù)要求高。此外，也可利用哺乳動物細胞(BHK21、LLC-MK2)或乳鼠顱內(nèi)接種作為登革病毒的分離培養(yǎng)方法。分離培養(yǎng)物可進一步利用間接免疫熒光法、RT-PCR或流式細胞術(shù)來檢測登革病毒的存在。

6.2.4 病毒核酸檢測與傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)方法相比，核酸檢測技術(shù)更為快速和敏感。對于登革病毒目前主要通過巢式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(巢式RT-PCR)檢測。但目前國外已有多篇文獻報道使用TaqMan Real-Time PCR方法檢測登革病毒，該方法敏感度高，特異性好，快速。TaqMan Real-Time PCR檢測登革病毒引物和探針序列見表1。

表1 Real-time PCR檢測登革病毒引物和探針序列[30]

7 結(jié)束語

登革熱已成為日益嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題，目前我國廣東省的登革熱防控形勢不容樂觀。由于沒有特異性針對登革熱的藥物和疫苗[31]，無法確切有效的針對病原體進行治療和免疫。加強對登革熱監(jiān)測和控制消滅媒介伊蚊則是當(dāng)前最有效的預(yù)防措施。希望各領(lǐng)域?qū)＜蚁嗷f(xié)作，通過對登革熱疫苗、抗病毒藥物以及早期診斷方法進行深入研究，提供更加有效的防控措施及治療方法，從而降低登革熱發(fā)病率及病死率。

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R373.3+3，R512.8

∶A

1674-1129(2014)06-0649-05

2014-10-13；

2014-10-28)

林迪，女，生于1987年10月，本科，技師，從事臨床微生物學(xué)檢驗。

孫長貴，男，生于1962年9月，碩士研究生導(dǎo)師，主任技師，教授。