葉廷巧，馬雙陶，李丹，鄭曦，王強(qiáng)，蘇立男，張彥，楊蕓，楊永健

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，成都 610083)

鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)是一種內(nèi)源性鈣蛋白酶(calpain)抑制劑，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，分子量大小約130 ×103，與鈣蛋白酶共同組成鈣蛋白酶系統(tǒng)，二者相互協(xié)調(diào)。CAST 抑制鈣蛋白酶的催化活性，以保證鈣蛋白酶只對(duì)底物局部的特定位點(diǎn)進(jìn)行水解，防止細(xì)胞發(fā)生自溶［1］。在各種心血管疾病發(fā)生過程中，鈣蛋白酶系統(tǒng)被認(rèn)為發(fā)揮著重要作用。此外，鈣蛋白酶系統(tǒng)還參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞增殖、分化、凋亡和膜融合等生理過程。國(guó)外有報(bào)道通過注射外源性鈣蛋白酶抑制劑可以抑制小鼠心肌梗死后心肌重構(gòu)的發(fā)生［2］。但是，內(nèi)源性CAST 的作用國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。因此，本研究擬構(gòu)建CAST 過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，這將為鈣蛋白酶系統(tǒng)的研究提供有用的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(川)2013－24】，共300 只，8 ～10 周齡，體重22 ～25 g，雌雄各半。

1.1.2 試劑

Gateway? BP ClonaseTMII Enzyme Mix(invitrogen 公司)，Gateway? LR ClonaseTMII Plus Enzyme Mix(Invitrogen 公司)，QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen 公司)，質(zhì)粒小提試劑盒(Tiangen 公司)，Taq DNA polymerase(美國(guó)Fermentas 公司)，dNTP Mix(美國(guó)Fermentas 公司)，PrimeSTARTMHS DNA Polymerase(Takara 公司)，GeneRulerTM1kb DNA ladder(Fermentas 公 司)，LA Taq (Takara 公 司)，PMD18－T Simple Vector(Takara 公司)，引物(Sangon Biotech 公司)，鼠尾基因組DNA 提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)，Premix Taq(Takara 公司)，RT－PCR 試劑盒(Takara 公司)，calpastatin 羊抗鼠的一抗(sc－7561，Santa 公司)。

1.2 方法

1.2.1 載體pRP. EX3d－EF1A－CAST－IRES－eGFP 的構(gòu)建及線性化DNA 片段的制備

含有attB 重組位點(diǎn)的目的片段與含有attP 重組位點(diǎn)的供體載體之間通過BP 反應(yīng)獲得含有“attL1－目的基因－attL2”的入門載體;含有“attL1－目的基因－attL2”的入門載體再與含有attR 重組位點(diǎn)的目的載體之間通過LR 反應(yīng)獲得“attB1－目的基因－attB2”的表達(dá)載體(圖1)。

圖1 載體構(gòu)建模式圖Fig．1 Pattern diagram of the construction of recombinant vectors

針對(duì)CAST 基因的CDS 序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(引 物 attB1－Kozak－CAST－F:5′－GGGGACAAGTTTG TACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGTCCCAGCCCG GCCAGA－3′;引 物 attB2－CAST－R:5′－GGGGACCA CTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGTCATCTTTTGG CTTGGAAGTTTCC－3′)，以正常人基因組DNA 為模板，由重疊PCR 擴(kuò)增、合成含有attB1－Kozak－CAST －attB2 目的基因的片段。利用Gateway clone 技術(shù)，經(jīng)BP 反應(yīng)將CAST 基因插入到載體pDown 上，合成pDown－CAST 目的基因的入門克隆;再 與pUp－EF1A，pDown－CAST，pTail－IRES－eGFP 和PRP.Des3d經(jīng)過LR 反應(yīng)形成pRP.Ex3d－EF1A－CAST－IRES－eGFP 表達(dá)載體。產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit 試劑盒純化、回收目的片段，并溶于顯微注射緩沖液(microinjection buffer，pH 7.4)中，至終濃度為3 ng/ μL。

1.2.2 顯微注射及子代小鼠F0的產(chǎn)生

將純化后的線性pRP. EX3d－EF1A－CAST－IRESeGFP 片段通過顯微注射法注入C57BL/6J 小鼠的受精卵雄原核中，挑選注射后狀態(tài)良好的受精卵，移植到假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，待F0代小鼠出生［3］。所有實(shí)驗(yàn)用小鼠均在SPF 級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)和繁殖，溫度控制在21℃，相對(duì)濕度55%，自動(dòng)光控(12 h 明/12 h 暗)。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定

小鼠在出生14 d 后用剪趾法標(biāo)記，并剪取0.5～1 cm 尾巴，采用鼠尾基因組DNA 提取試劑盒提取小鼠DNA，利用特異性的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，篩選出目的片段陽性的小鼠［4］。針對(duì)插入目的基因片段的上游引物為:5′－ACGTAAACGGCCACAAGTTC－3′，下游引物為:5′－GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC－3′，產(chǎn)物的長(zhǎng)度:440 bp。在50 μL PCR 體系中分別加入:Premix Taq 25 μL，引物各1 μL，模板DNA 8 μL，滅菌蒸餾水15 μL。反應(yīng)條件:94℃變性5 min，進(jìn)人循環(huán)(94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸27 s)，共30 個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)在72℃延伸10 min，4℃保存。取5μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。pRP.EX3d－EF1A－CAST－IRES－eGFP 作為陽性對(duì)照，野生型C57BL/6J 小鼠鼠尾DNA 作為陰性對(duì)照，并設(shè)立空白對(duì)照。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖

首建鼠分別與野生型的C57BL/6J 交配，所產(chǎn)的子代通過PCR 法鑒定篩選出陽性小鼠，分別建系。種鼠與C57BL/6J 回交2 代以上(最好7 代)，使遺傳背景趨于穩(wěn)定，同窩的陽性小鼠相互交配建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因小鼠系。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因小鼠組織中CSAT mRNA 表達(dá)的檢測(cè)

選取轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦和骨骼肌組織，采用Trizol 試劑提取組織總RNA。對(duì)提取的RNA 在反轉(zhuǎn)錄前進(jìn)行DNaseI 處理，并用酚、氯仿抽提以去除殘留的基因組DNA。采用RT－PCR 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 及PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果［5］。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中CAST 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)小鼠心臟中CAST 蛋白的表達(dá)。按照蛋白提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因陽性小鼠和同窩陰性小鼠的心臟總蛋白，經(jīng)SDS－PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，以CAST抗體為一抗，4℃孵育過夜，加入二抗后在37℃搖床中孵育1 h，將化學(xué)發(fā)光劑滴至PCDF 膜上，暗室曝光。用UVP 成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，以GAPDH 作為內(nèi)參。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 載體pRP．EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP 的構(gòu)建及鑒定

重疊PCR 融合attB1－Kozak－CAST －attB2 片段理論大小為2317 bp，切膠回收電泳圖條帶與理論大小相符(圖2)。結(jié)果表明:PCR 擴(kuò)增attB1－Kozak－CAST －attB2 基因片段成功。載體pRP.EX3d－EF1ACAST－IRES－eGFP 經(jīng)PCR 鑒定理論大小為440 bp，電泳圖中與理論大小相符的克隆即為陽性克隆(圖3)。結(jié)果表明:通過Gateway 技術(shù)成功構(gòu)建載體pRP.EX3d－EF1A－CAST－IRES－eGFP。

2.2 首建鼠的產(chǎn)生及基因型鑒定

共獲得存活的90 枚注射卵，分別移植到3 只假孕母鼠的輸卵管中，其中3 只母鼠均懷孕，移植成功率100%，產(chǎn)下23 只小鼠，經(jīng)PCR 鑒定，其中2 只小鼠為陽性，陽性率9%。陽性小鼠再次通過剪鼠尾提取基因組DNA，進(jìn)行PCR 檢測(cè)，確認(rèn)2 只為轉(zhuǎn)基因均為陽性小鼠(圖4)。

圖2 重疊PCR 融合目的片段attB1－Kozak－CAST －attB2 切膠回收結(jié)果Fig．2 PCR showing the recombinant fragments:attB1－Kozak－CAST－attB2

圖3 載體pRP.EX3d－EF1A－CAST－IRES－eGFP 的構(gòu)建結(jié)果Fig．3 Enzyme digestion showing the recombinant vector pRP.EX3d－EF1A－CAST－IRES－eGFP

2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖

2 只性成熟的首建鼠分別與C57BL/6J 小鼠回交，分別繁殖及建立相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，建系情況如表1 所示。

圖4 CSAT 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定結(jié)果Fig．4 Genotyping the CAST transgenic mice with PCR

表1 CAST 轉(zhuǎn)基因小鼠譜系的建立Tab．1 Construction of CAST transgenic mice lines

2.4 轉(zhuǎn)基因小鼠組織中CAST mRNA 的水平

經(jīng)RT－PCR 結(jié)果顯示:CAST mRNA 在轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦和骨骼肌組織中均有表達(dá)(圖5)。

2.5 轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中CAST 蛋白的表達(dá)

Western blotting 結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因陽性小鼠中CAST 蛋白表達(dá)水平明顯高于同窩陰性小鼠(圖6)。

3 討論

本研究通過Gateway 技術(shù)成功構(gòu)建載體pRP.EX3d－EF1A－CAST－IRES－eGFP，與傳統(tǒng)的克隆技術(shù)相比，該方法僅需兩步(入門克隆和表達(dá)克隆)便能達(dá)到目的，大大地簡(jiǎn)化了基因克隆和亞克隆的步驟，能夠快速、高效地將異源DNA 片段克隆到不同的載體中［6］。利用經(jīng)典的顯微注射法將線性化的pRP.EX3d－EF1A－CAST－IRES－eGFP 片段導(dǎo)入C57BL/6J 小鼠的受精卵中，并移植到假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，成功建立了2 只轉(zhuǎn)基因小鼠，且利用雙盲法對(duì)2 只轉(zhuǎn)基因小鼠再次通過剪鼠尾提取基因組DNA，進(jìn)行PCR 檢測(cè)，確保2 只為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建過程中，外源性蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)的蛋白是否具有生物學(xué)活性是技術(shù)的關(guān)鍵。我們進(jìn)一步通過RTPCR 檢測(cè)到CAST 基因在轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦和骨骼肌組織中均有表達(dá)，且免疫印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠較同窩野生型小鼠的心臟組織中CAST 蛋白表達(dá)水平顯著增加。綜上所述，通過Gateway 技術(shù)、顯微注射的方法能成功構(gòu)建CAST 轉(zhuǎn)基因小鼠，且能夠穩(wěn)定傳代，即CAST 轉(zhuǎn)基因小鼠在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平構(gòu)建成功。

圖5 轉(zhuǎn)基因陽性小鼠各組織中CAST mRNA 表達(dá)情況Fig．5 Expression of CAST mRNA in organ tissues from the transgenic mice

圖6 Western blotting 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠及同窩陰性小鼠心臟中CAST 蛋白的表達(dá)Fig．6 Expression of CAST protein in the heart of the transgenic mice and wild type littermates by Western blotting analysis

CAST 最早是在肌肉中分離、純化m－calpain 時(shí)發(fā)現(xiàn)的，并于1979年由Takashi Murachi 命名［7］，作為鈣蛋白酶的抑制蛋白，對(duì)calpain 的活性調(diào)控具有重要意義，且小鼠和人的基因具有高度同源性。研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶系統(tǒng)中calpain 小部分活化后通過作用于不同的底物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用，例如:細(xì)胞骨架的重構(gòu)、細(xì)胞周期性的凋亡、細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)［8］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，calpain 過度活化產(chǎn)生一系列的病理變化，例如:在心肌梗死后的心肌重構(gòu)過程中，calpain 過度活化會(huì)水解心肌細(xì)胞骨架、改變心肌纖維蛋白的組成、促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡、降低肌漿網(wǎng)的鈣調(diào)節(jié)能力［9］。Yang 等人在對(duì)瓣膜病所致的不同程度心力衰竭病人研究中發(fā)現(xiàn)，隨著心功能的惡化，calpain 的表達(dá)不斷升高［10］，類似的在肝硬化、帕金森病、缺血性腦損傷、糖尿病、癌癥等許多疾病中發(fā)現(xiàn)calpain 的活性均異常增高［11］。而CAST 作為calpain的抑制蛋白，提示我們，臨床上治療這些疾病時(shí)時(shí)，通過CAST 阻斷或抑制calpain 的活性可能是一個(gè)新的治療突破口。本研究成功構(gòu)建過表達(dá)的CAST 轉(zhuǎn)基因小鼠，為進(jìn)一步探討鈣蛋白酶系統(tǒng)在各種疾病中作用及機(jī)制提供了有用的工具。

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