劉峭梅覃柳燕（廣西壯族自治區(qū)血液中心，廣西柳州 545005）

隨著血液檢測(cè)技術(shù)的不斷更新，核酸檢測(cè)（NAT）技術(shù)作為一種新的血液病毒篩查檢測(cè)技術(shù)，由于可以直接檢測(cè)到病原體的核酸，檢測(cè)靈敏度高、特異好，可大大縮短檢測(cè)“窗口期”，能夠有效地降低經(jīng)輸血途徑傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)。在我國(guó)，已有一些血液中心和中心血站近幾年在血液篩查中引入NAT技術(shù)，該技術(shù)的引入對(duì)保證血液的安全性起到了很大的作用。本中心從2012年9月引進(jìn)了諾華診斷的Procleix TIGRIS System血液篩查系統(tǒng)，通過(guò)3個(gè)月的調(diào)試安裝和培訓(xùn)后于2012年12月起對(duì)柳州地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本進(jìn)行NAT，現(xiàn)在的檢測(cè)模式為2個(gè)不同生產(chǎn)廠家的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑和1種核酸試劑同時(shí)并行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)為NAT（＋）ELISA（－）的標(biāo)本進(jìn)行鑒別試驗(yàn)。我國(guó)2012版《血站技術(shù)操作規(guī)程》中對(duì)HBV、HCV、HIV標(biāo)志物及其檢測(cè)方法可有兩種選擇，一種是繼續(xù)采用2個(gè)不同生產(chǎn)廠家的ELISA試劑檢測(cè)，另一種選擇是1種ELISA試劑和1種核酸試劑檢測(cè)。作者對(duì)本單位2012年12月1日至2013年4月30日采集的18 236份無(wú)償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本NAT和ELISA的檢測(cè)結(jié)果以及核酸鑒別試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 2012年12月1日至2013年4月30日本中心采集的柳州地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本18 236份，獻(xiàn)血者均符合獻(xiàn)血者健康檢查要求。每位獻(xiàn)血者留取2管標(biāo)本，分別為5mL的二乙胺四乙酸四鉀（EDTA－K2）真空采血管（浙江拱東）和5mL的EDTA－K2分離膠真空采血管（上?？迫A），其中不含分離膠的采血管用于ELISA檢測(cè)，而含有分離膠的用于NAT檢測(cè)。NAT管采集后在4h內(nèi)離心，各檢測(cè)在標(biāo)本采集后48h內(nèi)完成，不能完成的－20℃密閉保存，7d內(nèi)檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑 EVO全自動(dòng)標(biāo)本處理系統(tǒng)；FAME24／30全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)；諾華Procleix TIGRIS NAT系統(tǒng)（美國(guó)Novartis）；乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）（1家國(guó)產(chǎn)試劑和1家進(jìn)口試劑）；抗－HCV（2家國(guó)產(chǎn)試劑）；抗－HIV（1家國(guó)產(chǎn)試劑）；HIV Ag／Ab（1家進(jìn)口試劑）；HIV－1RNA、HCV RNA、HBV DNA三聯(lián)檢核酸試劑（Procleix UltrioAssay）；HIV－1 RNA鑒 別 試 劑（Procleix HIV－1DiscriminatoryProbe Reagents）；HCV RNA鑒別試劑（Procleix HCV Discriminatory Probe Reagents）；HBV DNA鑒別試劑（Procleix HBV Discriminatory Probe Reagents）。所有使用的試劑均為合格試劑且在試劑有效期內(nèi)使用；所有的儀器均按儀器的要求進(jìn)行保養(yǎng)和維護(hù)，并確保儀器在正常工作狀態(tài)下運(yùn)轉(zhuǎn)。

1.3 方法 （1）ELISA檢測(cè)：將采血管按要求進(jìn)行離心，ELISA試劑室溫平衡后使用EVO一次性加樣針進(jìn)行全自動(dòng)加樣，采用FAME 24／30全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)進(jìn)行全自動(dòng)處理。ELISA兩種試劑使用不同的加樣系統(tǒng)、不同的分析系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)，按各試劑的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、操作規(guī)程進(jìn)行操作。ELISA兩種試劑均無(wú)反應(yīng)性的標(biāo)本判定ELISA陰性，兩種試劑均有反應(yīng)性的標(biāo)本判定ELISA陽(yáng)性；只有單一種ELISA試劑有反應(yīng)性的標(biāo)本需進(jìn)行原試劑雙孔復(fù)試，復(fù)試雙孔中有一孔或雙孔有反應(yīng)性的標(biāo)本判定ELISA陽(yáng)性，否則判定ELISA陰性。（2）單人份NAT：與ELISA檢測(cè)平行進(jìn)行。將含有EDTA－K2分離膠真空采血管按要求進(jìn)行離心，應(yīng)用Procleix TIGRIS System血液篩查系統(tǒng)ID－NAT檢測(cè)模式，采用ULTRIO篩查試劑進(jìn)行HIV－1RNA、HCV RNA、HBV DNA三聯(lián)檢NAT，篩查無(wú)反應(yīng)性的標(biāo)本為NAT陰性，篩查有反應(yīng)性的標(biāo)本為NAT陽(yáng)性；篩查有反應(yīng)性但ELISA檢測(cè)為陰性的標(biāo)本，用鑒別試劑進(jìn)行鑒別確定反應(yīng)性的項(xiàng)目。

2 結(jié) 果

2.1 共18 236份標(biāo)本，對(duì)HBV／HCV／HIV標(biāo)志物使用NAT與ELISA平行檢測(cè)，結(jié)果NAT陽(yáng)性標(biāo)本181份，ELISA陽(yáng)性246份，其中NAT陽(yáng)性且ELISA陽(yáng)性標(biāo)本117份，NAT陽(yáng)性且ELISA陰性的標(biāo)本64份，ELISA陽(yáng)性且NAT陰性標(biāo)本129份。結(jié)果見表1。

表1 18 236份標(biāo)本NAT、ELISA并行檢測(cè)結(jié)果[n（%）]

2.2 117份NAT陽(yáng)性且ELISA陽(yáng)性標(biāo)本中，HBsAg陽(yáng)性100份，占85.47%，其中國(guó)產(chǎn)試劑90份，進(jìn)口試劑100份；抗－HCV陽(yáng)性12份，占10.25%，國(guó)產(chǎn)試劑1為12份，國(guó)產(chǎn)試劑2為11份；抗－HIV陽(yáng)性7份，占5.98%，國(guó)產(chǎn)試劑，進(jìn)口試劑均能檢出。7份NAT陽(yáng)性且抗－HIV陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)疾病預(yù)防控制中心（CDC）確證為HIV陽(yáng)性。

2.3 64份NAT陽(yáng)性ELISA為陰性標(biāo)本經(jīng)鑒別試劑鑒別后，HBV DNA（＋）為18份，HCV RNA（＋）0份，HIV RNA（＋）0份，鑒別陽(yáng)性率為28.13%。

2.4 129份NAT陰性ELISA陽(yáng)性標(biāo)本中，HBsAg陽(yáng)性53份，其中國(guó)產(chǎn)試劑37份，進(jìn)口試劑39份，23份為兩種試劑均為陽(yáng)性；抗－HCV陽(yáng)性40份，國(guó)產(chǎn)試劑1為32份，國(guó)產(chǎn)試劑2為11份，有3份為兩種試劑均為陽(yáng)性；抗－HIV陽(yáng)性31份，其中，國(guó)產(chǎn)試劑5份，進(jìn)口試劑26份。

3 討 論

3.1 從表1中看到18 236份標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)NAT陽(yáng)性標(biāo)本181份，ELISA陽(yáng)性246份，NAT和ELISA都能夠有效地檢測(cè)出不合格標(biāo)本，但兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)檢出的陽(yáng)性標(biāo)本并不完全相同，只選擇其中一個(gè)都存在著漏檢的可能。從文中看到117份NAT（＋）、ELISA（＋）的標(biāo)本中100份為HBsAg（＋）占85.47%，12份抗－HCV（＋），7份抗－HIV（＋）。表明在獻(xiàn)血者血液中不合格的項(xiàng)目仍然是HBV。

3.2 從文中看到18 236份標(biāo)本中檢出64份NAT（＋）ELISA（－）的標(biāo)本，鑒別出18份HBV DNA（＋），HBV漏檢率0.99‰。HIV RNA和HCV RNA檢出為0，與國(guó)內(nèi)許多血站報(bào)道相一致。HBV 0.99‰的漏檢率與周邊幾個(gè)城市例如東莞0.9‰[1]，常州1.0‰[2]，南京0.99‰[3]，寶雞1.14‰[4]相近。值得注意的是在鑒別64份標(biāo)本中，有46份HBV／HCV／HIV鑒別試驗(yàn)為陰性，比例高達(dá)71.87%。這些標(biāo)本有可能為NAT假陽(yáng)性也有可能是病毒水平太低造成鑒別試驗(yàn)為陰性。姚鳳蘭等[5]報(bào)道認(rèn)為單人份NAT檢測(cè)時(shí)常規(guī)篩查檢測(cè)出的陽(yáng)性標(biāo)本不能被鑒別是哪種病毒陽(yáng)性，大多數(shù)并非NAT假陽(yáng)性而是真陽(yáng)性，之所以無(wú)法鑒別的原因是因?yàn)椴《舅教?。利用超速離心技術(shù)對(duì)NAT篩查陽(yáng)性鑒別試驗(yàn)為陰性的標(biāo)本進(jìn)行鑒別，使76.6%（23／30）的常規(guī)不能鑒別的標(biāo)本得到鑒別，確定為HBV[6]。由此可見現(xiàn)所采用的兩種試劑檢測(cè)HB－sAg均存著HBV漏檢的現(xiàn)象，NAT有利于提高乙型肝炎病毒的檢測(cè)能力。

3.3 對(duì)于129份NAT（－）ELISA（＋）的標(biāo)本，從文中看到HBsAg雙試劑陽(yáng)性23份，抗－HCV雙試劑陽(yáng)性3份，103份為ELISA單試劑陽(yáng)性。對(duì)這些標(biāo)本由于沒有進(jìn)行中和試驗(yàn)或其他的確證試驗(yàn)，也沒有進(jìn)行乙型肝炎病毒標(biāo)志物的相關(guān)檢測(cè)，因此無(wú)法鑒別所有的標(biāo)本是不是真正的陽(yáng)性標(biāo)本，存在著ELISA假陽(yáng)性的可能，但也存在著由于獻(xiàn)血者血液中病毒載量很低，低于NAT的檢出水平或病毒處在靜默期，導(dǎo)致NAT假陰性的可能。有報(bào)道，機(jī)體的長(zhǎng)期病毒感染導(dǎo)致血液中抗體或抗原滴度很高，不影響ELISA的檢出，但血液中存在的HB－sAg是由病毒DNA整合到人染色體與宿主基因共同表達(dá)所致，所以檢測(cè)不到血清中病毒HBV DNA[6]，造成NAT漏檢。

3.4 從文中看到現(xiàn)有的兩種ELISA試劑檢出的陽(yáng)性數(shù)是各不相同的。由于不同的ELISA試劑生產(chǎn)廠家包被的抗原、抗體片段不同或酶標(biāo)抗體的濃度以及對(duì)酶標(biāo)活性的保護(hù)方面采取的方法不同，造成各檢測(cè)試劑的特異性、靈敏度有所不同。從表中看到進(jìn)口試劑的靈敏度比國(guó)產(chǎn)試劑的靈敏度要高，檢出的標(biāo)本陽(yáng)性率比國(guó)產(chǎn)試劑要高，但兩種ELISA試劑中去掉任何一種都有漏檢測(cè)的可能。

綜上所述，NAT檢測(cè)方法能夠檢測(cè)出因“窗口期”感染、免疫靜默期感染、病毒變異等原因而漏檢的污染血液[7]，特別對(duì)乙型肝炎病毒的檢測(cè)能力有很大的提高，有條件的采供血單位應(yīng)開展NAT血液篩查，降低經(jīng)輸血途徑傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)。但也注意到ELISA可以檢測(cè)出那些病毒載量低的慢性或持續(xù)性感染以及處在病毒靜默期感染的標(biāo)本。WHO《血液篩查建議書》（2009）中建議在考慮將NAT列入篩查策略之前，應(yīng)首先保證已經(jīng)有效建立具有質(zhì)量保證的血清學(xué)篩查技術(shù)，并對(duì)所有的血液實(shí)施篩查[8]。從理論上，NAT檢測(cè)的是病毒核酸，ELISA檢測(cè)的是病毒抗原或抗體，兩者在檢測(cè)原理及方法上存在差異，因此這兩個(gè)方法對(duì)血液標(biāo)本的檢測(cè)都很重要但不是重復(fù)而是互相補(bǔ)充，不存在誰(shuí)替代誰(shuí)，這兩者都應(yīng)作為血液篩查檢測(cè)中的重要環(huán)節(jié)。在選擇兩種ELISA檢測(cè)策略中應(yīng)對(duì)ELISA試劑進(jìn)行考評(píng)，盡量選擇兩種互補(bǔ)性強(qiáng)的試劑，并建議在選擇HBsAg試劑時(shí)選擇高靈敏度、特異性強(qiáng)的進(jìn)口試劑；在實(shí)施NAT后去掉2種ELISA試劑中的任何一種均存在一定的漏檢可能，去掉哪種ELISA試劑，需要進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)效益評(píng)估。

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[5]姚鳳蘭，任芙蓉，王卓妍，等.超離心濃縮對(duì)提高血液NAT篩查不確定標(biāo)本鑒別率的臨床研究[J].北京醫(yī)學(xué)，2009，31（11）：687－690

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[7]顏秀娟，陸祝選，邱昌文，等.核酸檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于血清學(xué)篩查合格的獻(xiàn)血者標(biāo)本檢測(cè)[J].中國(guó)輸血雜志，2012，25（12）：1322－1324.

[8]郭永建，池泉，涂東晉，等.WHO血液篩查建議書主要內(nèi)容介紹[J].中國(guó)輸血雜志，2010，23（1）：66－72.