丁海峰，張緒利△，吳有才，梅雨珍，曾 華，張 辛（.黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生學(xué)院，湖北黃岡 438000；.湖北省黃岡市中心醫(yī)院泌尿生殖實(shí)驗(yàn)室 438000）

羥基磷灰石對(duì)細(xì)菌有明顯的吸附作用，且對(duì)細(xì)菌形態(tài)、生化反應(yīng)等特性無(wú)不良影響[1]。為進(jìn)一步探討羥基磷灰石在介質(zhì)生理鹽水、尿液、胸腔積液中對(duì)大腸埃希菌（EC）、金黃色葡萄球菌（SA）、銅綠假單胞菌（PA）、普通變形桿菌（PV）的濃集作用，試圖在日后作為制備尿液等臨床標(biāo)本的細(xì)菌濃縮劑，以提高細(xì)菌培養(yǎng)檢出率，特進(jìn)行下列試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 10%羥基磷灰石 按文獻(xiàn)[1]配制。羥基磷灰石購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司，符合Q／CYD2－R－223－99標(biāo)準(zhǔn)，批號(hào)為990518，是分離DNA試驗(yàn)的合格用品，分子式為Ca5（OH）（PO4）3＝504.1。

1.1.2 細(xì)菌懸液 所用菌種如大腸埃希菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）均為“藥敏”標(biāo)準(zhǔn)菌株，購(gòu)自北京藥品生物制品檢定所細(xì)菌保藏中心；普通變形桿菌由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室提供。在使用前經(jīng)常法復(fù)壯與鑒定，按比濁法配制4種細(xì)菌懸液，取每種菌液分別加入3種介質(zhì)中，逐級(jí)倍比稀釋配制而成，即生理鹽水菌液4種、尿菌液4種、胸腔積液菌液4種。將各種菌液濃度均調(diào)整為103CFU·mL－1。實(shí)際含菌數(shù)以傾注培養(yǎng)及其菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)。3種介質(zhì)來(lái)源：生理鹽水為醫(yī)用靜脈注射品；尿液標(biāo)本由黃岡市中心醫(yī)院泌尿生殖實(shí)驗(yàn)室提供，取自健康男性中段尿，比重為1.011；胸腔積液標(biāo)本由黃岡市中心醫(yī)院內(nèi)科提供，取自結(jié)核性胸膜炎患者，經(jīng)乙二胺四乙酸鈉鹽抗凝，抗凝劑：胸腔積液＝0.1∶6，密度1.031。3種介質(zhì)均篩選無(wú)菌者。

1.1.3 其他 菌落計(jì)數(shù)器，為JLQ－S1型（江蘇省無(wú)錫金城儀器廠）；加樣槍、吸咀、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司）等滅菌用品。

1.2 方法 采用常規(guī)對(duì)比實(shí)驗(yàn)法、離心沉淀法、傾注培養(yǎng)法與菌落計(jì)數(shù)法。對(duì)比實(shí)驗(yàn)法即分試驗(yàn)組和參照組；常規(guī)的方法需離心30min（3 000r／min），本試驗(yàn)組較常規(guī)離心法縮短15min。

1.2.1 試驗(yàn)組 取每種菌液1mL加10%羥基磷灰石0.5 mL，混勻6min，離心沉淀15min（3 000r／min），取上清液1 mL作傾注培養(yǎng)（剩下沉淀物0.5mL不作傾注培養(yǎng)），重復(fù)5份，然后由兩人用JLQ－S1型菌落計(jì)數(shù)器作菌落重復(fù)計(jì)數(shù)。因此每種菌液上清液的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，可得到10個(gè)數(shù)據(jù)，取其均值為該種菌液上清液菌落數(shù)。其沉淀物0.5mL不作傾注培養(yǎng)，但其中細(xì)菌數(shù)可據(jù)參照組菌落基數(shù)減去上清液菌落數(shù)而求得。

1.2.2 參照組 每種菌液均不作羥基磷灰石處理，也不離心沉淀，目的在于測(cè)知每種菌液中所含細(xì)菌的實(shí)際參照基數(shù)。即另取相應(yīng)菌液1mL按常規(guī)作傾注培養(yǎng)，重復(fù)5份，進(jìn)行雙人計(jì)數(shù)，取10個(gè)數(shù)據(jù)的均值，即為參照組菌落基數(shù)。

1.3 細(xì)菌濃集率 將試驗(yàn)組和參照組所得到的數(shù)據(jù)，按公式計(jì)算細(xì)菌濃集率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0進(jìn)行分析，率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

羥基磷灰石分別在介質(zhì)生理鹽水、尿液、胸腔積液中對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌均有明顯的濃集作用（濃集率為93.79%～95.83%），且離心時(shí)間較常法縮短15min。細(xì)菌種類和標(biāo)本種類對(duì)濃集率無(wú)明顯影響，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 羥基磷灰石在3種介質(zhì)中對(duì)4種細(xì)菌的濃集作用

3 討 論

3.1 羥基磷灰石的特性及其吸附作用 羥基磷灰石[1－3]是一種新型的環(huán)境功能性材料，是一種具有良好生物相容性的生物材料，有較大的比表面積及有效的表面活性。羥基磷灰石具有良好的吸附作用，不僅可以吸附陽(yáng)離子，也可以吸附陰離子，對(duì)重金屬的吸附具有優(yōu)勢(shì)，對(duì)不同氨基酸的吸附強(qiáng)度各不相同，對(duì)L－谷氨酸有顯著吸附作用，廣泛用于核酸和蛋白質(zhì)的純化?，F(xiàn)已證實(shí)，羥基磷灰石對(duì)細(xì)菌有明顯的吸附作用。

羥基磷灰石有不同類型的產(chǎn)品，微溶于水，易沉淀。含結(jié)構(gòu)碳酸根的羥基磷灰石，因?yàn)镃O32－的進(jìn)入使羥基磷灰石結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯畸變，其結(jié)晶度下降，顆粒分散性好且小。以磷酸氫二銨、硝酸鈣和氫氧化鈉為起始原料，采用溶膠－凝膠法可合成5種羥基磷灰石。

本實(shí)驗(yàn)研究工作中應(yīng)用的是分離DNA的合格用品，在光學(xué)顯微鏡下呈薄片狀，為不規(guī)則三角形、四邊形、五邊形和六棱形，大小不一，無(wú)色半透明，細(xì)菌被吸附在表面。利用羥基磷灰石易沉降和易吸附細(xì)菌的特性，通過(guò)離心，細(xì)菌很快被濃集。故比常規(guī)的離心沉淀法縮短15min。因此羥基磷灰石可試用于臨床體液標(biāo)本的濃縮集菌。

3.2 羥基磷灰石在3種介質(zhì)中對(duì)4種細(xì)菌的作用 生理鹽水常用于配制細(xì)菌懸液，尿液、胸腔積液是臨床常見的體液標(biāo)本。羥基磷灰石在這3種介質(zhì)中對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌有明顯的吸附作用，這種吸附作用既不受介質(zhì)種類的影響，也不受細(xì)菌種類的影響。這4種細(xì)菌是尿液、胸腔積液等體液標(biāo)本中常出現(xiàn)的細(xì)菌[4－8]，若將羥基磷灰石制成尿液、胸腔積液等體液標(biāo)本的細(xì)菌濃縮劑，從理論上講是可行的。至于羥基磷灰石在其他介質(zhì)中對(duì)其他細(xì)菌或其他病原體是否有吸附作用和濃集作用尚未見報(bào)道。

3.3 羥基磷灰石作為尿液中細(xì)菌濃縮劑更具有臨床實(shí)用意義

在臨床體液標(biāo)本中，尿液是最常見的標(biāo)本之一。目前，尿液標(biāo)本的細(xì)菌檢查有培養(yǎng)法和尿沉渣細(xì)菌定量計(jì)數(shù)法等[9－17]。鄧益斌等[10]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)尿沉渣細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果呈陰性時(shí)，可無(wú)需進(jìn)行尿液細(xì)菌培養(yǎng)就可發(fā)陰性報(bào)告，只有當(dāng)尿沉渣細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果呈陽(yáng)性時(shí)，才需要做尿液細(xì)菌培養(yǎng)以進(jìn)一步確診。吳麗芳等[13]用UF1000i型全自動(dòng)尿有形成分分析儀檢測(cè)尿沉渣中的細(xì)菌，敏感度和特異度都比較高，而且有很高的陰性預(yù)測(cè)率，可快速、簡(jiǎn)捷地檢測(cè)細(xì)菌，但卻不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)。因此，細(xì)菌培養(yǎng)仍是尿液細(xì)菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。為提高其細(xì)菌培養(yǎng)檢出率，常采用離心沉淀法濃縮集菌[14]。

3.4 本實(shí)驗(yàn)研究細(xì)菌濃集率計(jì)算說(shuō)明 在本實(shí)驗(yàn)研究中，之所以用上清液中的細(xì)菌數(shù)作為計(jì)算濃集率的數(shù)據(jù)，是因?yàn)槌恋砦镏屑?xì)菌被吸附于羥基磷灰石上，作傾注培養(yǎng)后，細(xì)菌常堆積，不便于計(jì)數(shù)，故設(shè)立本文中前述的計(jì)算公式。

3.5 其他標(biāo)本的濃縮集菌法簡(jiǎn)介 其他標(biāo)本的濃縮集菌法最多見的是痰液濃縮集菌法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，有常規(guī)的漂浮法和離心沉淀法[18]。此外，還采用夾層杯離心涂片集菌法檢測(cè)胸腹水中的抗酸桿菌[19]，即將胸腔積液、腹水加入彭氏杯，置專用離心機(jī)中離心，沉淀細(xì)菌于杯底基片，取基片作抗酸染色鏡檢。還有采用試管漂浮集菌法檢測(cè)胸腔積液、腹水中的結(jié)核菌；采用濾膜集菌法檢測(cè)血液中的細(xì)菌等。

[1]張緒利，賈瑛，方曉紅.羥基磷灰石對(duì)細(xì)菌生物學(xué)特性的影響[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2005，26（9）：662.

[2]李賓杰，姚素梅，李淑蓮，等.納米羥基磷灰石的制備及在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化學(xué)研究，2010，21（5）：90－96.

[3]王丹軍，郭莉，付峰，等.羥基磷灰石粉體的制備及生物學(xué)活性的研究[J].化學(xué)與生物工程，2010，27（3）：25－26.

[4]葉文君，黃琴香.醫(yī)院泌尿道感染病原菌分布及耐藥性分析[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，11（4）：394－396.

[5]詹燏，張紅梅，汪慧，等.泌尿系統(tǒng)感染病原菌分布及耐藥性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（4）：845－847.

[6]劉曉平，蔡朝陽(yáng)，邵小華，等.泌尿系統(tǒng)感染分離的病原菌分布及耐藥性分析[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2012，10（4）：614－615.

[7]張傳領(lǐng)，韓立中，倪語(yǔ)星，等.1275株泌尿道感染病原菌分布及耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，19（11）：1147－1149.

[8]劉勇.736份尿液細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果的分析[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10（25）：549－550.

[9]王金華，張磊，李偉.評(píng)價(jià)UF－500i尿沉渣分析儀在診斷尿路感染中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，9（3）：289－291.

[10]鄧益斌，張梁，鄧巧瑩，等.尿沉渣細(xì)菌定量計(jì)數(shù)與尿液細(xì)菌培養(yǎng)比較及其在篩查泌尿系統(tǒng)感染中的臨床應(yīng)用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14（3）：449－450.

[11]鐘日輝，黃松音，李文靜.某型全自動(dòng)尿液分析儀在門診患者尿路感染快速診斷中的作用[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（13）：1425.

[12]崔艷梅，李晶，張捷.利用UF1000i細(xì)菌定量結(jié)果篩選尿液細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，16（7）：1258－1259.

[13]吳麗芳，陳翔，胡型忠，等.UF－1000i尿沉渣分析儀與尿液干化學(xué)分析儀聯(lián)合運(yùn)用在判斷尿路感染診斷中的價(jià)值探討[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（10）：2403－2404.

[14]顧蕓霞，陳慶，邱潮林，等.離心集菌法在尿培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27（3）：227－228.

[15]陶慶春，楊會(huì)敏.加強(qiáng)尿液細(xì)菌培養(yǎng)規(guī)范化問(wèn)題的探討[J].北京中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19（5）：1181－1182.

[16]何雨峰.使用尿液流式分析儀UF－1000i進(jìn)行尿液檢測(cè)的研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（18）：2091－2093.

[17]陳紅霞，黃艷，王貞斐，等.FUS－100尿沉渣分析儀在住院患者尿路感染篩檢中的應(yīng)用[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2012，24（11）：1035.

[18]史煜波，翁幸鐾，胡麗慶，等，改良離心集菌法檢測(cè)痰內(nèi)抗酸桿菌的研究[J]，中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2012，24（8）：751－753.

[19]王淑俠，梅存金，劉成永，等.夾層杯離心涂片集菌法檢測(cè)胸腹水抗酸桿菌的初步觀察[J].臨床肺科雜志，2010，15（3）：368－369.