聶益軍（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)胞室，南昌 330006）

血型是指各種血液成分（包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等）的遺傳多態(tài)性，ABO血型為人類紅細(xì)胞的表面抗原，是一種穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記。正常情況下，血型的遺傳標(biāo)記不會(huì)改變，但某些疾?。ò籽?、惡性腫瘤等）會(huì)引起ABO血型抗原或其血清抗體減弱，導(dǎo)致暫時(shí)性的“血型變異”，從而難以及時(shí)、準(zhǔn)確地對ABO血型進(jìn)行鑒定。由于疾病對ABO血型的影響多局限于免疫血清學(xué)，而發(fā)生在基因水平上的改變概率較小，因此基因分型是正確鑒定血型不可或缺的輔助手段?，F(xiàn)將所涉及抗原及抗體減弱的案例舉例說明并加以分析討論。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者標(biāo)本來源于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011～2012年ABO血型抗原或抗體減弱的臨床標(biāo)本，共計(jì)27例，發(fā)病年齡15～62歲，血型鑒定前3個(gè)月均無輸血史。其中男14例，女13例；惡性腫瘤導(dǎo)致的ABO血型抗原或抗體減弱的臨床標(biāo)本10例，白血病導(dǎo)致的ABO血型抗原或抗體減弱的臨床標(biāo)本17例；ABO血型抗原減弱的19例，ABO血型抗體減弱的8例。分別選取A型和B型抗原減弱各1例，O型抗體減弱兩例進(jìn)行探討分析。

1.2 儀器與試劑 單克隆抗－A，抗－B，ABO試劑紅細(xì)胞均由上海血液生物制品提供，離心機(jī)為日本久保田KA－2200臺(tái)式離心機(jī)；DNA提取試劑Gene One Technology（美國產(chǎn)）；人類ABO血型基因檢測試劑盒[序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR－SSP法）]為天津秀鵬產(chǎn)品；9700擴(kuò)增儀（美國ABI公司）；凝膠成像儀（美國BIO－RAD）。

1.3 方法

1.3.1 ABO血型血清學(xué)鑒定 ABO血型鑒定為正、反定型，均采用試管法，具體操作見《中國輸血技術(shù)操作規(guī)程》。

1.3.2 ABO血型基因?qū)W鑒定（PCR－SSP法）

1.3.2.1 DNA提取 900μL的溶液L1及300μL的全血振蕩后離心棄上清液，振蕩以打破核細(xì)胞團(tuán)。加入200μL L2 Buffer，振蕩后將溶解物放入離心柱子中離心并棄去過濾液。加入400μL溶液W1到離心柱子中，離心并棄去過濾液。加入600μL溶液W2到離心柱子中，離心并棄去過濾液。將離心柱子轉(zhuǎn)移另一干凈的離心管中，加入Elution Buffer（60～65℃），浸泡1min后離心30s，移去離心柱子，獲得DNA。

1.3.2.2 加樣 44μL dNTP－Buffer＋56μL純水＋0.8 μLTaq酶（5U／μL）＋10μLDNA。

1.3.2.3 擴(kuò)增 96℃，2min；1個(gè)循環(huán)→96℃，20s；68℃，60s；5個(gè)循環(huán)→96℃，20s；65℃，45s；72℃，30s；15個(gè)循環(huán)→96℃，20s；62℃，45s；72℃，30s；15個(gè)循環(huán)→72℃，3 min；→4℃保存。

1.3.3 電泳 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳并根據(jù)格局表判定結(jié)果。

1.3.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.4.1 ABO血型抗原減弱的判定 患者紅細(xì)胞與單克隆抗－A和（或）抗－B反應(yīng)凝集強(qiáng)度未達(dá)到（＋＋＋）者，包括出現(xiàn)混合凝集時(shí)均判定為ABO抗原減弱[1]。

1.3.4.2 ABO血型抗體減弱的判定 用標(biāo)準(zhǔn)A細(xì)胞和（或）B紅細(xì)胞與患者血清反應(yīng)，凡室溫反應(yīng)低于或等于（＋）凝集者均判定為ABO抗體減弱[1]。

1.3.4.3 ABO血型基因?qū)W方法 采用PCR－SSP，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后在紫外燈下兩個(gè)條帶為陽性，只有一個(gè)條帶為陰性（內(nèi)對照）。根據(jù)格局反應(yīng)判定血型。

2 結(jié) 果

2.1 試驗(yàn)結(jié)果4例血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 見表1。

表1 血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

圖1 基因?qū)W電泳圖像

2.2 基因?qū)W電泳圖像 例1和例2的基因?qū)W電泳圖像見圖1。

3 討 論

ABO血型是人類最重要的一個(gè)血型系統(tǒng)，其檢測多采用血清學(xué)正反定型方法，任何影響抗原或抗體改變的因素均可干擾ABO血型定型的結(jié)果。1957年Van Loghem等[2]首先報(bào)道了急性粒細(xì)胞白血?。ˋML）患者A抗原減弱，國內(nèi)也有相關(guān)血液疾病導(dǎo)致ABO血型抗原減弱的報(bào)道[3－4]。但目前白血病及其他一些血液病導(dǎo)致紅細(xì)胞ABO血型抗原減弱的原因及確切機(jī)制尚未明確，國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為與下列因素有關(guān)：（1）與體內(nèi)血型基因突變有關(guān)聯(lián)。ABO血型抗原基因位于9號(hào)染色體，位于同一染色體的病毒致癌基因c－abl可干擾ABO基因的合成，導(dǎo)致患者紅細(xì)胞A和（或）B抗原減弱。又由于基因突變也可導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶活性降低，使H抗原轉(zhuǎn)變?yōu)锳或B抗原的過程阻斷，而導(dǎo)致血型抗原減弱。（2）粒細(xì)胞白血病患者粒細(xì)胞異常增生，使紅系細(xì)胞增生相對受到抑制，其紅細(xì)胞的代謝受到干擾，紅系增生受抑，造成A、B、H抗原物質(zhì)減弱。（3）也可能與體內(nèi)唾液黏蛋白產(chǎn)生過多，遮蓋了紅細(xì)胞表面的抗原部位而導(dǎo)致血型抗原強(qiáng)度變化有關(guān)。近年來的研究更多地放在分子生物學(xué)的調(diào)控機(jī)制上，認(rèn)為在啟動(dòng)子區(qū)CpG島內(nèi)發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子附近有多個(gè)特異性半甲基化位點(diǎn)，可能是引起ABO抗原弱表達(dá)的原因[5]。有研究表明，造成ABO血型抗原減弱的原因是ABO基因位于人類第9號(hào)染色體上，其啟動(dòng)子區(qū)域富含CpG島。ABO基因的表達(dá)受到近端啟動(dòng)子甲基化程度的影響，甲基化程度越高，ABO基因的表達(dá)就越不活躍，從而導(dǎo)致A、B抗原表達(dá)減少[6]。2009年有研究檢測了21例患者的ABO位點(diǎn)拷貝數(shù)及DNA甲基化變化，其中11例存在1個(gè)或2個(gè)ABO等位基因表達(dá)缺失，另10例患者未檢測到ABO mRNA等位基因表達(dá)缺失。而在這11例ABO等位基因表達(dá)缺失的患者中，有8例（73%）的ABO基因啟動(dòng)子存在甲基化狀態(tài)[7]。此外，基因突變、染色體易位也可能使血型基因丟失或被掩蓋[8]。

本次研究對象中有19例抗原表達(dá)減弱，減弱程度從±至＋＋不等（與單克隆抗－A和（或）抗－B反應(yīng)的凝集程度），這其中有12例為白血病患者，7例為腫瘤患者。白血病患者抗原減弱可能是由于粒細(xì)胞的異常增生導(dǎo)致紅系增生受抑造成。而腫瘤患者可能與蛋白分泌過多有關(guān)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有急性白血病造成的ABO抗原減弱，在試管法檢測中均表現(xiàn)為混合凝集視野。這是由于疾病在急性發(fā)作之前或緩解之后患者紅細(xì)胞上的抗原相對正常，而急性發(fā)作期間紅細(xì)胞上的ABO抗原急劇減弱所形成的現(xiàn)象[1]。

惡性腫瘤疾病造成抗體減弱可能是由于3方面原因：（1）放化療時(shí)造成的機(jī)體正常免疫功能受到破壞；（2）腫瘤細(xì)胞的大量生長抑制了正常免疫細(xì)胞的活性；（3）大量失血。

本次研究對象中有8例血清抗體減弱，這是由于疾病、化療等造成機(jī)體各大器官衰竭，體內(nèi)免疫系統(tǒng)抑制，影響了免疫應(yīng)答過程，使體液免疫、細(xì)胞免疫甚至固有免疫水平下降，出現(xiàn)嚴(yán)重感染或機(jī)會(huì)性感染就會(huì)大大增加，感染又會(huì)加重免疫抑制，進(jìn)而使B淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化的某一個(gè)階段出現(xiàn)異常，抑制漿細(xì)胞生成，引起抗體水平下降。但令人關(guān)注的是同樣為O型患者表現(xiàn)的抗體減弱形式也不盡相同。O型患者抗體減弱可以表現(xiàn)為抗－A和抗－B同時(shí)減弱，因?yàn)镺型個(gè)體的抗－AB不是抗－A和抗－B的混合物，抗－AB識(shí)別的是A抗原和B抗原上共同的表位。O型患者也可變現(xiàn)為抗－A或抗－B的單獨(dú)減弱，可能是因?yàn)闄C(jī)體免疫系統(tǒng)受到侵害造成免疫球蛋白低下，進(jìn)而使得免疫球蛋白分泌紊亂而造成抗－A或抗－B的單獨(dú)減弱。也可能是一種免疫耐受現(xiàn)象，在其胚胎發(fā)育早期接觸母體的A或B型抗原物質(zhì)，經(jīng)胎盤流入體內(nèi)，反復(fù)刺激而發(fā)生免疫耐受現(xiàn)象，致使機(jī)體對該抗原不能產(chǎn)生免疫反應(yīng)而相應(yīng)地不產(chǎn)生抗－A或抗－B[9]。

由于疾病對ABO血型的影響多局限于免疫血清學(xué)，而發(fā)生在基因水平上的改變概率較小，因此基因分型是正確鑒定血型不可或缺的輔助手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測基因結(jié)構(gòu)的方法不斷涌現(xiàn)，尤其是與PCR技術(shù)結(jié)合的檢測技術(shù)進(jìn)一步推動(dòng)了基因研究的發(fā)展。紅細(xì)胞血型分子生物學(xué)有多種，包括PCR－SSP、序列特異性寡核苷酸探針聚合酶鏈反應(yīng)（PCR－SSOP）、聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性（PCRRFLP）、PCR－DNA測序、基因芯片等[10]。本次試驗(yàn)研究中，對于ABO血型抗原或抗體減弱的確定就是通過ABO基因分型最終確定的，作者采用PCR－SSP法，其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便、結(jié)果直觀（圖1所示）。序列特異性引物引導(dǎo)的PCR反應(yīng)（PCRSSP法）的原理是根據(jù)不同類型核心序列關(guān)鍵幾處堿基的差異設(shè)計(jì)一系列具有等位基因序列特異性的引物，從對應(yīng)類型的核心序列起始擴(kuò)增，直接擴(kuò)增具有各種序列差異的等位基因特異性片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離可以呈現(xiàn)不同的擴(kuò)增片段圖譜從而分析判定標(biāo)本的基因型。用分子生物學(xué)分型技術(shù)對紅細(xì)胞抗原的基因型作鑒定其圖像直觀而清晰，同時(shí)還可以不受血清中自身抗體、不規(guī)則抗體、疾病和假、弱凝集的影響，對保證臨床安全輸血具有重要意義。

總之，ABO血型抗原減弱血清學(xué)試驗(yàn)多表現(xiàn)為混合凝集；O型個(gè)體抗體減弱可以表現(xiàn)為單一抗體減弱也可表現(xiàn)為抗－A及抗－B抗體同時(shí)減弱。對于在疾病發(fā)作期而難以正確定型的患者可進(jìn)行ABO分子生物學(xué)試驗(yàn)，從基因型上確定患者ABO血型。必要時(shí)，可待患者疾病緩解后復(fù)查ABO血型，以便給患者一個(gè)真實(shí)、明確的ABO血型結(jié)果，為今后的臨床輸血提供支持和保障。

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