陳元文，喬正榮，吳誠義，董華英（.重慶市第五人民醫(yī)院普外科 40006；.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外科，重慶 40006）

腫瘤干／祖細胞具有無限的擴增和自我更新能力，對化療藥物有天然的抵抗力，是影響乳腺癌化療效果的重要因素之一，也是乳腺癌復發(fā)的根源[1]。為了揭示乳腺浸潤導管癌干／祖細胞在化療后的變化及機制，本研究通過人乳腺癌原代細胞無血清懸浮培養(yǎng)，研究新輔助化療后乳腺導管癌干／祖細胞克隆形成情況，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年4月至2011年3月重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院收治的經(jīng)病理檢查確診為乳腺浸潤性導管癌的住院患者55例，根據(jù)是否化療分為兩組，化療組25例，術前接受新輔助化療方案（多西他賽＋表柔吡星＋環(huán)磷酰胺），接受1個療程化療5例、2個療程5例和3個療程15例。未化療組30例，未接受過化療。標本的收集征得患者及家屬同意，并在血供阻斷前從新鮮腫瘤組織邊緣，無囊變、壞死、鈣化及電凝的部位小心、無菌取材，所取組織立即置于由DMEM／F12加抗菌藥物制成的標本取樣液中，于15min內(nèi)送至細胞培養(yǎng)室立即處理，如不能立即處理則保存于4℃冰箱，24h內(nèi)完成接種。手術過程中獲取55例乳腺癌活體標本。

1.2 儀器與試劑 胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM／F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司；血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）購自Peprotech公司；B27添加劑購自Gibco公司；鼠抗人CD34單克隆抗體、鼠抗人nestin抗體及抗ESA抗體購自邁新生物技術公司；紅細胞裂解液購自碧云天生物公司。本實驗在重慶市眼科學重點實驗室完成。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與傳代 標本在無菌條件下剪成約1mm3大小組織塊，吸管反復吹打，200目細胞篩濾過、1 000r／min離心5min，加入紅細胞裂解液離心，去除紅細胞、死細胞及其他組織碎片，除去上清液。經(jīng)此處理，未化療標本可獲取大量單細胞懸液，化療后標本則獲取的是細胞集團，為表述方便稱之為“化療細胞微球”。用含有20U／L EGF、20U／L bFGF和2%B27添加劑的DMEM／F12無血清培養(yǎng)基重新懸浮，并接種于培養(yǎng)瓶。3～5d換液1次。每日在相差顯微鏡下觀察非黏附性乳腺癌細胞微球（MS）的形成和生長過程。待培養(yǎng)瓶內(nèi)背景干凈后，收集MS，離心后去除上清液，加入含0.25%胰酶－EDTA的磷酸鹽緩沖液（PBS）緩沖液，室溫下孵育10min，并用巴氏管輕輕吹打，將MS酶解成單細胞，400×g離心5min，收集單細胞，并以DMEM／F12重懸，400目（孔徑40 μm）細胞篩濾過，取1滴細胞懸液加入4%臺盼藍細胞染色，檢測細胞活性，紅細胞計數(shù)器下計數(shù)細胞數(shù)。制作的單細胞懸液供后面實驗用。

1.3.2 免疫熒光分析乳腺癌微球細胞表型鑒定 將單細胞懸液涂抹到多聚賴氨酸處理過的載玻片上，制作細胞涂片；略干后以4%多聚甲醛固定10min備用；0.5%Triton穿孔15min；吸取1%山羊血清滴加其上，置于染色濕盒中，37℃孵育30min；加入1%BSA稀釋的一抗（抗CD34、抗nestin、抗ESA），于37℃孵育2h；加入1%BSA稀釋的二抗（抗IgGFITC或抗IgG－Rhodamine），于37℃雜交1h；每步間以PBS漂洗2次，每次5min。緩沖甘油封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 二次非黏附性乳腺細胞微球培養(yǎng)和單克隆形成實驗將化療組原代細胞球和未化療組第1代乳腺球單細胞，以含生長因子的無血清培養(yǎng)液重懸，細胞計數(shù)后以每孔100個細胞接種于24孔培養(yǎng)板，進行第2次非黏附性乳腺球培養(yǎng)。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3周，每周觀察克隆形成情況，以檢測自我更新能力和克隆形成能力。

1.3.4 乳腺微球細胞的誘導分化和逆向分化 取生長狀況良好的細胞微球，重懸于含有10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基中，以1×106／孔接種于放有經(jīng)多聚賴氨酸預處理蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)，3～5d更換培養(yǎng)基1次，于倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察細胞分化和生長情況。培養(yǎng)10d后取出蓋玻片。

1.3.5 乳腺球細胞體內(nèi)成瘤能力分析 參照平軼芳等[2]的方法。實驗用動物為4～6周無胸腺雌性裸鼠。動物分為化療接種組、未化療接種組和分化細胞接種組（對照組），每組5只。取化療組“化療細胞微球”、未化療組的乳腺球細胞和血清誘導分化的乳腺癌細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化、PBS洗滌2次后，用PBS調(diào)整密度為1×106／mL。按每只裸鼠0.1mL（1×105細胞）細胞懸液接種于裸鼠左前胸部皮下，各隨機接種5只裸鼠。繼續(xù)飼養(yǎng)并觀察成瘤情況及腫瘤生長情況。每周測量移植瘤的最長徑（L）和最寬徑（W）并依據(jù)公式計算移植瘤的體積（V）：V＝L×W／2。術后6周處死取材，經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，做4μm切片，用于HE染色，做組織學檢查及光鏡觀察。

2 結 果

2.1 大體形態(tài)比較 未化療組標本切面呈灰白色，組織鮮活，細胞生長旺盛。接受一個療程化療的乳腺癌標本，可見大片壞死組織和存活組織共存。2個療程化療后標本，腫塊明顯縮小，壞死組織較少；3個療程化療標本腫塊進一步縮小，結構纖維化，質(zhì)地變硬。

2.2 新輔助化療后乳腺癌組織富含乳腺癌干／祖細胞球 免疫熒光檢測CD34、nestin蛋白和上皮特異性抗原ESA，結果顯示所有標本的CD34和nestin蛋白均未見明顯表達，而上皮特異性抗原ESA則呈強陽性表達。標本經(jīng)機械剪切和200目細胞篩濾過后，重懸并接種于培養(yǎng)瓶中，立即鏡下觀察細胞狀態(tài)。顯微鏡下可見未化療組以單細胞為主，亦可見極少量外形不規(guī)則的細胞團，團內(nèi)細胞直徑小，細胞間連接松散，間有結締組織（圖1）；接種2～3d后，細胞團均崩解、消失，單細胞大部分死亡，只有少量體積較大、較亮的細胞呈懸浮性生長，并開始分裂形成細胞微球；術前接受新輔助化療的25例標本，其中，經(jīng)3個療程化療的8例標本鏡下鮮見存活的腫瘤細胞，未能獲得足夠的細胞進行培養(yǎng)。另外標本，鏡下所見單細胞較少，但可見大量細胞團，呈球形，外形規(guī)則，團內(nèi)細胞大，細胞間連接緊密，很多細胞尚處在分裂過程中，細胞間未見明顯的纖維結締組織，形態(tài)與未化療組形成的細胞微球極其相似（圖2）。這種“化療細胞微球”在不含生長因子的無血清培養(yǎng)基中可繼續(xù)存活，表面少部分細胞死亡，大部分細胞則持續(xù)保持活力。

圖1 未化療患者乳腺癌細胞被分解為單細胞（光鏡×200）

圖2 化療后患者乳腺癌內(nèi)的癌細胞集落（光鏡×40）

2.3 化療組原代細胞球內(nèi)細胞具有自我更新能力和克隆形成能力 化療組的“化療細胞微球”和未化療組第1代乳腺微球制作成單細胞后，均可在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)生長，再次形成細胞微球，表現(xiàn)出自我更新和克隆形成能力等干細胞特性。

2.4 化療組原代細胞球具有多向分化潛能 用胎牛血清對化療組“化療細胞微球”和未化療組乳腺癌細胞微球的細胞誘導分化，兩者均可貼壁分化形成扁平的多突起形細胞。收集這些貼壁細胞制作成單細胞懸液，進行無血清培養(yǎng)，可再次形成MS。

2.5 移植裸鼠的形態(tài)學觀察 注射“化療細胞微球”和未化療組的乳腺球細胞2周后，觸摸注射部位形成結，突出于皮下；3～4周，大體觀察隆起物逐漸變大；6周時處死動物獲取標本，見標本呈灰白色，質(zhì)韌，較小，約0.5～1.0cm，包繞一層疏松結締組織。類似于乳腺腺體樣組織。對照組的分化細胞未見轉(zhuǎn)移瘤形成。

3 討 論

Dontu等[3]借鑒培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的神經(jīng)細胞球法發(fā)展了MS培養(yǎng)體系。在這種含bFGF、EGF的無血清培養(yǎng)液構成的非黏附、非分化的培養(yǎng)環(huán)境中，乳腺細胞可繼續(xù)存活并擴增成被稱作MS的非黏附性細胞集落，其內(nèi)的細胞不表達分化腔上皮、肌上皮等分化標志物，在分化條件下培養(yǎng)具有多系分化的能力，致瘤性也明顯提高，提示其內(nèi)的細胞為乳腺干／祖細胞，即乳腺細胞球是一種乳腺干／祖細胞集落，非黏附性乳腺細胞微球懸浮培養(yǎng)法也成為乳腺干／祖細胞體外培養(yǎng)的一種常規(guī)方法[4－5]。

本研究觀察到，接受新輔助化療的標本，組織內(nèi)的腫瘤細胞主要以由多細胞組成的“化療細胞微球”形式存在，單細胞很少。這種細胞微球不同于離解不完全的細胞團，主要表現(xiàn)在以下幾方面，（1）外形不同：細胞團不規(guī)則，團內(nèi)細胞直徑小，細胞間連接松散，間有較多結締組織。“化療細胞微球”呈球形，外形規(guī)則，團內(nèi)細胞大，細胞間連接緊密，很多細胞尚處在分裂過程中，細胞間未見明顯的纖維結締組織。（2）在無血清培養(yǎng)基中生長狀況不同。（3）構成細胞不同：未化療組細胞團的主體是分化細胞，而化療組細胞團以未分化細胞為主?！盎熂毎颉笨煞€(wěn)定傳代形成克隆，經(jīng)血清誘導可貼壁分化，1 000個細胞可在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤，證明其具有自我更新能力、分化能力和成瘤能力等干細胞特性。因此，“化療細胞球”富含未分化的干／祖細胞。分析其原因，腫瘤干細胞通過不對稱性分裂產(chǎn)生大量分化細胞，以對稱性分裂進行自我復制。未化療腫瘤組織內(nèi)的細胞大部分為分化細胞，干細胞數(shù)量極少。由于腫瘤干細胞大多處于細胞周期中的G0期休眠狀態(tài)，且高表達多藥耐藥蛋白和ATP結合盒式蛋白，能將進入細胞內(nèi)的化療藥物泵出；高表達bcl－2和survivin等抗凋亡蛋白[6－7]，這些特點使得腫瘤干細胞對化療藥物有天然的抵抗力，對常規(guī)化療不敏感。占腫瘤細胞主體的分化細胞，很容易被化療藥物殺滅，腫瘤干細胞得以保留。同時，不對稱性分裂方式被抑制，對稱性分裂被保留，進行自我復制，形成干／祖細胞集落，即本研究觀察到的“化療細胞球”。

同時本研究還觀察到，經(jīng)過兩個療程化療的乳腺癌組織內(nèi)“化療細胞球”最豐富，3個療程后則明顯下降。表明化療藥物對乳腺癌干／祖細胞仍有抑制作用，其作用機制可能是對干／祖細胞的殺傷，但更可能是破壞了干／祖細胞生存的微環(huán)境[8]，如血管的破壞與纖維化等。因此，少次化療可有效富集乳腺干／祖細胞，不僅提高實驗獲取干／祖細胞的效率[9]，還可應用于判斷化療的效果。

本研究顯示，3個療程的化療雖然有效殺滅了乳腺癌腫瘤分化細胞，但干／祖細胞仍部分存留，提示乳腺癌化療應堅持3個療程以上。

[1]Al－Hajj M，Wicha MS，Benito－Hernandez A，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].PNAS，2003，100（7）：3983－3988.

[2]平軼芳，卞修武，姚小紅，等.人膠質(zhì)瘤干細胞趨化因子受體CXCR4活化促進血管生成的作用[J].中華病理學雜志，2007，36（3）：179－183.

[3]Dontu G，Abdallah WM，F(xiàn)oley JM，et al.In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem／progenitor cells[J].Genes Dev，2003，17（10）：1253－1270.

[4]Smart CE，Morrison BJ，Saunus JM，et al.In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates interand intrasphere heterogeneity[J].PLoS One，2013，8（6）：e64388.

[5]Paranjape AN，Mandal T，Mukherjee G，et al.Introduction of SV40ER and hTERT into mammospheres generates breast cancer cells with stem cell properties[J].Oncogene，2012，31（15）：1896－1909.

[6]李治，黃韜，賀艷麗，等.乳腺癌干細胞逃逸化療機制的研究[J].中華實驗外科雜志，2007，24（1）：20－21.

[7]沈松杰，孫強.乳腺癌化療耐藥中腫瘤干細胞的作用及其機制[J].中華腫瘤防治雜志，2011，18（16）：1312－1315.

[8]Sun H，Jia J，Wang X，et al.CD44＋／CD24－breast cancer cells isolated from MCF－7cultures exhibit enhanced angiogenic properties[J].Clin Transl Oncol，2013，15（1）：46－54.

[9]李海志，易彤波，武正炎.懸浮培養(yǎng)聯(lián)合化療藥物篩選乳腺癌干細胞[J].中國癌癥雜志，2008，18（3）：172－175.