楊靜娜，孫玉娣，關(guān) 毅

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072）

微生物燃料電池（M icrobial Fuel Cell，簡稱MFC）是指在微生物的催化作用下將有機物的化學(xué)能轉(zhuǎn)變成電能的裝置［1］。由于 MFC可以將各種有機質(zhì)直接轉(zhuǎn)化成電能，不僅能量轉(zhuǎn)化率高、無污染，而且在獲得電能的同時可以凈化廢水、廢物，消減或消除污染，MFC日益受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注［2-4］。1910年英國植物學(xué)家Potter以葡萄糖為底物，酵母和大腸桿菌為產(chǎn)電微生物，在MFC中獲得了電壓［4］，此后，MFC在空間科學(xué)研究領(lǐng)域取得了較大進展。MFC具有能源轉(zhuǎn)化效率高、燃料來源廣泛、反應(yīng)條件溫和、環(huán)保無污染等特點，成為極具希望緩解能源短缺問題的新技術(shù)。

日益增長的能源需求與環(huán)境危機促使人們關(guān)注可再生能源的發(fā)展［5-6］。微生物燃料電池在能量轉(zhuǎn)化過程中減少了燃燒步驟，使其轉(zhuǎn)化效率大大提高，具有很廣闊的應(yīng)用前景，研究者們已經(jīng)在其結(jié)構(gòu)設(shè)計和提高輸出功率方面取得了很大進展［7-12］。但是目前微生物燃料電池的電子回收率和電流密度都不高，因此選取高活性的微生物尤其重要［13］。乳酸菌作為產(chǎn)電微生物具備如下優(yōu)勢：來源廣泛，生長迅速；作為耐氧厭氧型，用其制成的MFC適用性廣泛；對人體與環(huán)境安全無害；遺傳背景較為清楚，便于機理研究。張鑫［14］等以乳酸菌為產(chǎn)電微生物，MFC的最大輸出電壓為637.2 mV，說明以乳酸菌為產(chǎn)電菌是可行的，具有良好效果。

MFC系統(tǒng)底物直接影響著產(chǎn)電能力［15］，葡萄糖是微生物新陳代謝不可缺少的碳源，其氧化反應(yīng)釋放的能量是微生物生命活動所需能量的重要來源［16］，因此選擇葡萄糖作為 MFC的底物。本研究采用1.5 g/L葡萄糖溶液作為陽極液，0.1 mol/L的鐵氰化鉀溶液作為陰極液，環(huán)境溫度為30℃。通過考察乳酸菌產(chǎn)電過程中pH值、陽極液中乳酸菌菌數(shù)、葡萄糖濃度、化學(xué)耗氧量（COD）、代謝產(chǎn)物（主要是醛、醇和酸類）的變化，并且設(shè)置空白對照實驗即乳酸菌生物膜電極在非產(chǎn)電的情況（生物膜電極在單個瓶中進行厭氧發(fā)酵），以此來分析乳酸菌產(chǎn)電的主要代謝過程。

微生物燃料電池的研究逐漸增多，在生物部分的研究包括產(chǎn)電微生物的選擇、產(chǎn)電微生物細胞內(nèi)的電子傳遞以及微生物與電極之間的電子傳遞機理等，其中產(chǎn)電微生物的生理學(xué)特性以及具體的產(chǎn)電機制的檢測存在一定困難。本實驗選取高活性的乳酸菌作為產(chǎn)電微生物，首次以氣相色譜手段分析乳酸菌代謝產(chǎn)物的含量來判斷產(chǎn)電過程中乳酸菌的產(chǎn)電機理。

1 實驗裝置和方法

1.1 實驗裝置

本實驗采用自制的雙室微生物燃料電池系統(tǒng)，它主要是由2個等容積的圓形玻璃反應(yīng)器（高10 cm，底面直徑6 cm）組成，有效體積為250 mL。反應(yīng)器間有管路連接，管路中間用4×4 cm2的N117質(zhì)子交換膜（上海河森電氣有限公司）將兩反應(yīng)器隔開，在使用之前要經(jīng)過消毒處理。電池系統(tǒng)的電極均采用經(jīng)處理后的碳紙電極（HCP030，上海河森電氣有限公司），電極尺寸為4×2.5 cm2。

1.2 菌種與運行條件

微生物菌種取自某乳業(yè)污水，經(jīng)分離純化培養(yǎng)馴化后備用。菌種培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基。MFC的陽極液由1.5 g/L的葡萄糖和磷酸鹽緩沖液組成，陰極液采用鐵氰化鉀溶液。陽極陰極pH值均調(diào)節(jié)到7.0。

1.3 分析與測試

1.3.1 M FC產(chǎn)電性能測試

在雙室微生物燃料電池系統(tǒng)中進行乳酸菌MFC的啟動，首先將電極置于MRS培養(yǎng)液中放于4℃冰箱1周或以上使細菌形成的生物膜牢固附著于碳紙上，然后將乳酸菌的生物膜陽極放入微生物燃料電池反應(yīng)器中，陽極室加入COD為1.5 g/L的陽極液，進行產(chǎn)電性能的實驗。

MFC的產(chǎn)電性能通常以最大輸出功率密度來表示，待MFC系統(tǒng)穩(wěn)定后，將外阻在50～10000Ω區(qū)間內(nèi)逐漸增大，記錄在不同外阻條件下電池的輸出電壓，計算輸出功率。根據(jù)P=U2/R，當R=r時，功率達到最大Pmax=U2/4r。由于微生物生長的電極面積會對產(chǎn)能產(chǎn)生影響，因此單位面積或體積產(chǎn)生的功率更能說明微生物產(chǎn)電的情況，本實驗采用陽極面積功率密度，陽極面積為 A，計算公式如式（1）。

1.3.2 葡萄糖濃度和COD去除率的測定

葡萄糖濃度的測定：在氫氧化鈉和苯酚存在下，3，5-二硝基水楊酸（DNS）與還原糖在沸水浴中反應(yīng)生成3-氨基-5硝基水楊酸。在過量的氫氧化鈉堿性溶液中此化合物呈橘紅色，在540nm處有最大吸收峰，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系。本實驗采用北京瑞利分析儀器公司的UV-9200紫外可見分光光度計在540nm波長下測定反應(yīng)生成物的吸光度，以此來確定底物葡萄糖的濃度。

COD去除率的測定：采用重鉻酸鉀法測定。

1.3.3 乳酸菌M FC代謝產(chǎn)物成分及含量的檢測

采用北京瑞利分析儀器公司生產(chǎn)的SP-2100氣相色譜儀，色譜柱為石英毛細管柱，分別用頂空氣相色譜法和甲酯化法測定代謝產(chǎn)物的含量。

1.3.3.1 頂空氣相色譜法測定乙醇及乙醛含量

色譜操作條件：柱溫40℃（0.21min）→90℃（3.00min）10℃/min，進樣器 110℃，F(xiàn)ID檢測器：130℃。氮氣 10 mL/min，氫氣 10 mL/min，氧氣20 mL/min。

1.3.3.2 甲酯化法測定乙酸及乳酸含量

色譜操作條件：柱溫80℃（0.21min）→110℃（0.51min）10℃/min，110℃（0.21min）→210℃（0.51min）20℃/min進樣器220℃，F(xiàn)ID檢測器：230℃。氮氣 10 mL/min，氫氣 10 mL/min，氧氣20 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 電壓和功率密度曲線

在室溫條件下，乳酸菌MFC以1.5 g/L葡萄糖為底物，圖1給出了電池的開路電壓隨時間的變化關(guān)系和乳酸菌MFC的功率密度曲線。

由圖1a）可以看出，乳酸菌在經(jīng)過1.8 d的適應(yīng)期開路電壓由820 mV降至500 mV，然后電壓雖然有一定程度的下降，但是仍處于相對穩(wěn)定的水平。在運行7 d后由于底物葡萄糖的大量消耗，電壓明顯下降。待乳酸菌MFC系統(tǒng)運行穩(wěn)定后，將外阻在50～10000Ω區(qū)間內(nèi)逐漸增大，記錄不同電阻下電池的電壓值，從而計算出不同外阻時電池的電流和功率密度。圖1b）是乳酸菌MFC的功率密度曲線。由圖1可知，功率密度隨電流的增大而增大，增至最大值后，電流進一步增大，功率密度卻迅速降低。這是由于電流隨外部電阻的減小而增加，當外部電阻減小到較小值，電流增加至較大值時，發(fā)生了近似短路的情況，導(dǎo)致輸出功率密度迅速降低。在該實驗條件下，乳酸菌MFC在500Ω外阻條件下獲得393.23 mW/m2的最大輸出功率密度，即其內(nèi)阻約為500Ω。

圖1 乳酸菌MFC開路電壓a）和功率密度b）Fig.1 Open-Circuit voltage a）and power density b）of the lactic acid bacteria MFC

2.2 產(chǎn)電過程中各參數(shù)的情況對比

圖2是乳酸菌MFC產(chǎn)電過程及空白對照的pH值，乳酸菌菌數(shù)，葡萄糖濃度和COD去除率的變化。

圖2 產(chǎn)電過程中各參數(shù)的變化：a）pH值；b）乳酸菌菌數(shù)；c）葡萄糖濃度；d）COD去除率Fig.2 Each parameter changers in the process of producing electricity：a）pH value； b）the number of lactic acid bacteria； c）glucose concentration；d）removal rate of COD

張培遠等［17］發(fā)現(xiàn)，隨著 MFC的運行，陽極液的pH值會呈現(xiàn)下降的趨勢，然而由圖2a）可知產(chǎn)電過程和空白對照的pH值變化均不明顯，出現(xiàn)這樣的結(jié)果是由于溶液中均存在著磷酸鹽緩沖液。由圖2b）可知，產(chǎn)電和非產(chǎn)電實驗的乳酸菌數(shù)總體均為增長，但產(chǎn)電比非產(chǎn)電實驗乳酸菌菌數(shù)波動要大些，到第6 d隨著葡萄糖的消耗乳酸菌菌數(shù)均開始減少。從圖2c）中可以看出兩者葡萄糖濃度的下降趨勢相同，而產(chǎn)電過程中消耗的葡萄糖量低于空白對照。從圖2d）中可以看出，隨著時間的延長，COD的去除率均在增加，并且產(chǎn)電過程的COD去除率要低于空白對照實驗。圖2c）和圖2d）說明產(chǎn)電過程提高了乳酸菌對能量的利用率，減少了葡萄糖的消耗。

產(chǎn)電過程中乳酸菌菌數(shù)有變化，但是由圖1a）可知，MFC的開路電壓沒有受菌數(shù)波動的影響而發(fā)生明顯變化，這說明溶液中的細菌對產(chǎn)電的貢獻微乎其微，對產(chǎn)電起主要作用的是陽極生物膜的細菌。根據(jù)連靜等［18-19］的發(fā)現(xiàn)，電流達到穩(wěn)定平臺的時間就是微生物吸附在電極上并形成成熟生物膜所需的時間，電流的大小受生物膜的影響。生物膜形成初期，微生物與接觸面之間以及微生物之間相互作用，一旦足夠多的細胞聚集起來，細胞通過分泌的胞外物質(zhì)將彼此連接而形成生物膜。MFC產(chǎn)生電壓主要是由于細菌吸附在電極表面而致，并不是由于懸浮在溶液中的細菌所致，所以菌數(shù)的變化對開路電壓影響不大。但是溶液中的細菌數(shù)與COD去除率有著一定的關(guān)系，當電池運行初期或細菌呈對數(shù)生長期間，COD的去除率也迅猛升高。細菌生長的初期及對數(shù)期均需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)來進行合成代謝，以提供自身生長必須得核糖體、酶類和ATP等，因此最初和對數(shù)生長期COD大量消耗，之后細菌進入生長穩(wěn)定期，COD下降緩慢。在MFC產(chǎn)電過程中，隨著葡萄糖濃度的降低，開路電壓并未隨之明顯下降，分析其原因：一部分是因為葡萄糖已經(jīng)轉(zhuǎn)化為代謝中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物進一步代謝產(chǎn)生電能；另一部分是由于葡萄糖消耗完后，有機底物不足，細胞內(nèi)源呼吸的作用。

2.3 乳酸菌產(chǎn)電過程中代謝產(chǎn)物含量變化

圖 3a），圖 3b），圖 3c）和圖 3d）分別是酵母菌MFC產(chǎn)電過程及空白對照溶液中的乙醛、乙醇、乙酸和乳酸含量的變化。

對于乙醛的含量變化，在空白對照中，乙醛的產(chǎn)量在1周內(nèi)相對較穩(wěn)定，在0.1 g/L左右，而在參與產(chǎn)電的樣品中，乙醛的產(chǎn)量在第2 d達到最高值，第4 d再次達到一次高值。對于乙醇的含量變化，在空白對照中乙醇的產(chǎn)量在1周的時間內(nèi)較穩(wěn)定，在0.02 g/L左右，而在參與產(chǎn)電的樣品中，乙醇的含量明顯高于空白對照中乙醇含量。在空白對照中，乙醛和乙醇的含量均相對較穩(wěn)定，說明乳酸菌在以葡萄糖為底物而非產(chǎn)電的情況下，各反應(yīng)達到相對平衡，整個體系處于穩(wěn)定狀態(tài)。而乳酸菌在產(chǎn)電過程中，乙醇含量明顯較高，說明產(chǎn)電環(huán)境可能會促進乳酸菌的異型乳酸發(fā)酵的經(jīng)典途徑。在空白對照中，乙酸的含量先由低到高，經(jīng)再次升高后下降，最后又升高，總體上不穩(wěn)定。在產(chǎn)電樣品中，乙酸含量也是先升高再降低。乳酸的產(chǎn)量無論是在非產(chǎn)電的正常代謝途徑，還是參與產(chǎn)電的代謝途徑，均比較低，均低于0.1 g/L，但是變化趨勢均為先升高，再降低，再緩慢升高。但是在空白對照中，高峰的出現(xiàn)要遲于產(chǎn)電的分析樣品，這說明產(chǎn)電環(huán)境促進乳酸的生成。

圖3 乳酸菌M FC產(chǎn)電過程各代謝產(chǎn)物含量變化Fig.3 The content changes of acetaldehyde in the lactic acid bacteria MFC power production process

2.4 結(jié)果與分析

在產(chǎn)電和非產(chǎn)電過程中，均檢測到乙醛、乙醇、乙酸和乳酸的存在，因此代謝中均可能涉及到乳酸菌的同型乳酸發(fā)酵途徑、異型乳酸發(fā)酵的經(jīng)典途徑和雙歧桿菌途徑，見圖4。假設(shè)乳酸菌產(chǎn)電過程中只涉及這幾種途徑中的一種，根據(jù)各種代謝產(chǎn)物的量來計算參與各反應(yīng)的葡萄糖量，這卻是沒有解的一組方程組。從而推斷，乳酸菌在MFC中的代謝可能是多種途徑的共同結(jié)果。

為了判斷可能的主要產(chǎn)電途徑，設(shè)計試驗在產(chǎn)電過程中人為添加乙醇。乳酸菌MFC開路電壓穩(wěn)定在480 mV，在第2 d添加乙醇濃度為2 g/L。圖5是MFC添加乙醇前后各項數(shù)據(jù)的變化情況。

由圖5可知添加乙醇后電壓在0.2 d之內(nèi)急劇下降，降至320 mV之后仍繼續(xù)緩慢下降，在添加2 d之后電壓降至154 mV。添加乙醇之后，溶液的pH值略有升高，乳酸菌正常生長。產(chǎn)電樣品中，加入乙醇之后乙醇、乙醛、乙酸和乳酸的變化均較明顯。加入乙醇之前，乙醛含量較低，加入乙醇之后產(chǎn)電樣品中乙醛量增至0.68 g/L，第4 d稍下降，乙醇量變化與之相反。乙酸和乳酸均是在加入乙醇后的1 d內(nèi)變化不大，2 d后急劇升高。

圖4 乳酸菌發(fā)酵途徑Fig.4 Fermentation pathway of lactic acid bacteria

在3種發(fā)酵途徑中，生成乙醇的途徑是異型乳酸發(fā)酵之經(jīng)典途徑。在體系中人為添加乙醇之后，由化學(xué)平衡可知，生成乙醇的正反應(yīng)受到了一定程度的阻礙，而其逆反應(yīng)則在一定程度上進行，因此加入乙醇之后導(dǎo)致了乙醛和乳酸的大量積累。乳酸的增多導(dǎo)致溶液的pH值下降，進而影響乙酸的形成。乳酸菌MFC加入乙醇之后電壓先急劇下降之后又緩慢下降，這說明乙醇的添加不利于產(chǎn)電，乙醇的加入抑制了異型乳酸發(fā)酵經(jīng)典途徑，阻斷了電子的傳遞，從而導(dǎo)致了電壓的降低。因此可以推斷，該途徑（異型乳酸發(fā)酵之經(jīng)典途徑）是乳酸菌進行產(chǎn)電的主要代謝途徑。

微生物與電極之間的直接接觸是MFC電子轉(zhuǎn)移的主要途徑之一，生物膜上的微生物自身可以產(chǎn)生可溶性氧化還原電子中介體，可溶性中介體分散在陽極表面生物膜中參與底物的轉(zhuǎn)化和電子的傳遞［20］，細菌均是利用細胞分泌的多糖等物質(zhì)將其與碳纖維連接起來的。為了看清乳酸菌的形貌，對乳酸菌的生物膜電極做環(huán)境掃描電鏡分析。圖6是乳酸菌的SEM照片，可以看出，乳酸菌黏附在碳纖維表面，實驗過程中并沒有外加中介體，得到了較高的開路電壓，說明乳酸菌可以通過自身將電子轉(zhuǎn)移到電極表面。

圖5 M FC添加乙醇后各項數(shù)據(jù)Fig.5 Open-Circuit voltage in MFC

3 結(jié)論

1）30℃條件下，以葡萄糖為唯一的電子供體，初始濃度為1.5 g/L，雙室微生物燃料電池可以連續(xù)產(chǎn)電，開路電壓為500 mV，最大輸出功率密度為393.23 mW/m2，內(nèi)阻約為500Ω。

圖6 乳酸菌生物膜電極的環(huán)境掃描電鏡Fig.6 SEM of the lactic acid bacteria biofilm electrode

2）乳酸菌MFC的數(shù)據(jù)表明，在產(chǎn)電和非產(chǎn)電過程中都有可能涉及到乳酸菌的同型乳酸發(fā)酵途徑、異型乳酸發(fā)酵的經(jīng)典途徑和雙歧桿菌途徑。乙醇的添加實驗表明異型乳酸菌發(fā)酵的經(jīng)典途徑是乳酸菌進行產(chǎn)電的主要途徑。

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