劉芹，魏曉鋒，田立立，高誠2，

(1.復(fù)旦大學(xué)，上海 200032;2.上海市計劃生育科學(xué)研究所，上海 200032;3.上海實驗動物研究中心，上海 201203)

諾瓦克病毒(Norwalk-like viruses，NLV)，也稱為諾如病毒(Noroviruses，NVs)或小圓結(jié)構(gòu)病毒(Small round structured virus)，是一種高致病性、低致病劑量病毒［1］，該病毒于1972 年由Kapikian［2］應(yīng)用免疫電鏡(IEM)從患者糞便標本中首次找到致病病毒顆粒，將其命名為諾瓦克病毒(Norwalk viruses，NVs)。

小鼠諾瓦克病毒(MNV)屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，無包膜，呈線性，是單股正鏈RNA 病毒［3］，基因組RNA 長約7.4 kb，3’端有一個多聚A 尾結(jié)構(gòu)，5’端共價連接病毒蛋白VPg［4］。NVs 的RNA 基因組由三個主要的開放閱讀框(Open Reading Frames，ORFs)組成［5，6］。據(jù)文獻報道小鼠諾瓦克病毒(Murine norovirus，MNV)是目前發(fā)現(xiàn)的第一個能在細胞內(nèi)增殖的諾瓦克病毒，它既可以在原代巨噬細胞和樹突狀細胞內(nèi)生長，也可以在傳代細胞小鼠巨噬細胞系RAW264.7 細胞內(nèi)生長并產(chǎn)生細胞病變效應(yīng)(cytopathic effects，CPE)［7］，同時，MNV 被認為是實驗小鼠內(nèi)流行最廣泛的一種病毒，其在小鼠中的感染率是排在第二位的細小病毒的10 倍［8］。目前國內(nèi)對MNV 的相關(guān)研究較少，2010 年袁文等［9］對廣東省內(nèi)7 個小鼠繁育設(shè)施進行了MNV 感染情況的調(diào)查，陽性率為37.38%，這是國內(nèi)首次有關(guān)實驗小鼠攜帶MNV 的報道。本實驗利用RTPCR 方法及ELISA 方法對上海地區(qū)各實驗動物生產(chǎn)或使用機構(gòu)送檢小鼠的MNV 感染狀況進行調(diào)查研究，并對兩種檢測方法的結(jié)果進行分析比較。

1 材料和方法

1.1 動物、MNV 毒株及細胞

動物:上海地區(qū)實驗動物生產(chǎn)或使用單位委托上海市實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢驗站檢測的實驗小鼠，采樣時間為2012 年11 月至2013 年8 月，共13 家檢測單位的319 只SPF 級小鼠。MNV 毒株(MNV strain Guangzhou/K162/09/CHN， GenBank 序 列 號:HQ317203.1)由廣東省實驗動物監(jiān)測所贈送。實驗所用RAW264.7 細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 主要試劑

AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，recombinant RNase inhibitor(RRI)，dNTP(2.5/10 mmol/L)，Oligo d(T)18Primer，rTaq DNA 聚合酶，DNA 分子量marker 等購自Takara 公司;病毒RNA 提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)購自Qiagen 公司;ELISA 試劑盒購自Biotech Trading Partners(SMART-M35，美國);DMEM、FBS、Pen-Strep 購自美國GIBCO 公司。

1.3 RT-PCR 方法

1.3.1 樣本采集及處理

小鼠安樂死后，無菌采集約米粒大小的小鼠盲腸內(nèi)容物，置于去RNA 酶的1.5 mL 離心管內(nèi)，加入400 μL DEPC 水配置的無菌PBS 溶液，震蕩渦旋30 s，4000 g/min 離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾待用。

1.3.2 RNA 提取

按照QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒說明書進行操作，提取所采集盲腸內(nèi)容物樣本總RNA，取預(yù)處理樣本140 μL，最終得到60 μL 總RNA，測量RNA 濃度，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物

根據(jù)文獻［10］報道，由Invitrogen(上海)公司合成，上游引物F:CAGATCACATGCTTCCCAC，下游引物R :AGACCACAAAAGACTCATCAC，引物位于MNV 序列保守區(qū)域衣殼蛋白基因ORF2 編碼區(qū)位置，其擴增產(chǎn)物大小為187 bp(5473-5659nt)。

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄

在去RNA 酶的0.2 mL 離心管內(nèi)依次加入如下試劑:模板RNA 4 μL，5 × AMV buffer 4 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，RRI 0.5 μL，AMV 1μL，Oligo d(T)181μL，DEPC-H2O 補足反應(yīng)體系至20 μL?；靹蚝笫覝胤胖?0 min，42℃水浴1 h，置冰上冷卻2 min，得到的反應(yīng)產(chǎn)物即為cDNA。

1.3.5 PCR

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進行PCR 擴增，在一無菌的0.2 mL 離心管內(nèi)依次加入cDNA 模板4 μL，10 ×PCR buffer(Mg2+free)2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.6 μL，MgCl21.2 μL，上下游引物F/R(20 μmol/L)各0.4 μL，rTaq DNA 聚合酶0.2 μL，滅菌ddH2O 補足反應(yīng)體系至20 μL，混勻。95℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。每次反應(yīng)均以ddH2O 替代模板cDNA 做陰性對照，以廣東MNV 毒株為陽性對照進行RT-PCR 擴增。

1.3.6 凝膠電泳及測序

取PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，純化回收陽性產(chǎn)物，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定，用NCBI 的BLAST 軟件對測序結(jié)果進行分析。

1.4 血清學(xué)方法

1.4.1 樣本處理

無菌條件下采用摘眼球法采集小鼠血液，室溫靜置2 h，3000 r/min 離心10 min，小心將上層血清吸出分裝，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

參考相關(guān)文獻［11］，采用美國Biotech Trading Partners 公司的ELISA 試劑盒(SMART-M35)，按照試劑盒說明書進行操作:取經(jīng)RT-PCR 檢測小鼠中的180 份凍存血清進行檢測，血清樣本及試劑盒內(nèi)的標準液均作50 倍稀釋，陰陽性對照不稀釋，孵育30 min，洗板，加酶結(jié)合物孵育30 min，洗板，加底物顯色10 min，加入終止液輕拍混勻，用酶標儀測450 nm光吸收值并分析結(jié)果。

1.5 病毒分離

取2 個RT-PCR 檢測結(jié)果為陽性的樣本進行病毒分離。復(fù)蘇RAW264.7 細胞，用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。待細胞在24 h 內(nèi)長滿培養(yǎng)瓶90%左右時，棄去原來的培養(yǎng)液，并用DMEM 沖洗兩次，將糞便樣本用PBS 溶液稀釋并通過0.22 μm 濾膜過濾，取100 μL 濾液輕輕覆蓋在細胞表面，放37℃5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，期間每隔15 min 輕輕晃動培養(yǎng)瓶，防止細胞表面干涸。1 h 后棄去接種病毒液，立即加入含4%胎牛血清的DMEM 維持液并于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72 h 內(nèi)觀察細胞是否出現(xiàn)CPE。因樣本中可能含有其他致細胞病變物質(zhì)，可將細胞凍融三次后的過濾液繼續(xù)進行盲傳，待細胞能在24～72 h 內(nèi)出現(xiàn)穩(wěn)定的CPE 時，將細胞凍融三次后回收病毒并用RT-PCR方法鑒定，保存在－80℃。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.1 版本統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料以±s 表示，比較采用t 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR 產(chǎn)物電泳及測序結(jié)果

PCR 產(chǎn)物電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，陽性樣本在187 bp 處顯示目的條帶，與陽性對照位置一致(圖1)。送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，PCR 產(chǎn)物大小為187 bp。應(yīng)用NCBI 的BLAST 軟件對測序結(jié)果進行分析顯示，與GenBank 中登陸的廣州株(HQ317203)核酸同源性為99.5%(圖2)，由此可證實引物擴增的片段為MNV 基因片段，陽性檢測結(jié)果的小鼠有MNV 感染。GenBank 中登陸的MNV毒株多為歐美國家，也有亞洲的韓國、日本、中國臺灣，中國大陸登錄株為廣州株(HQ317203)。

圖1 部分樣本RT-PCR 電泳結(jié)果Note:M:DNA marker DL2000;Lane 1-12:samples;Lane 13:positive control;Lane14:negative controlFig.1 Electrophoresis of RT-PCR products from some samples

2.2 RT-PCR 檢測結(jié)果

RT-PCR 檢測的319 份盲腸內(nèi)容物樣本中95 份為陽性，陽性率為29.78%。13 家送檢單位的實驗小鼠均有MNV 檢出，陽性率最低為11.11%，最高為91.67%，卡方檢驗分析顯示不同送檢單位之間的MNV 自然感染率差異有顯著性(P＜0.05)(表1)。近交系、封閉群、免疫缺陷小鼠和基因工程小鼠均有MNV 感染，不同品系的實驗小鼠之間MNV感染狀況也不同，卡方檢驗分析顯示不同品系小鼠之間的MNV 自然感染率差異有顯著性(P＜0.05)，其中ICR 小鼠陽性率最高(47.13%)，而免疫缺陷小鼠陽性率最低(13.95%)(表2)。

2.3 ELISA 檢測結(jié)果

ELISA 檢測的180 份血清樣本中有70 份血清抗體陽性，陽性率為38.89%。11 家送檢單位均有抗體陽性檢出，陽性率在14.29%到75%之間，卡方檢驗分析顯示不同送檢單位之間的MNV 抗體陽性率差異有顯著性(P＜0.05)(表1)。不同品系小鼠間MNV 抗體陽性率差異有顯著性(P＜0.05)，封閉群ICR 小鼠MNV 抗體陽性率最高(71.05%)，免疫缺陷小鼠陽性率最低(25%)(表2)。

2.4 共同檢測結(jié)果

在同時經(jīng)過RT-PCR 擴增和ELISA 檢測的180只小鼠中，陽性小鼠分別為45 只和70 只，陽性率分別為25%和38.89%，兩種方法同為陽性的有34只，陽性率為18.89%。

2.5 病毒分離結(jié)果

陽性樣本經(jīng)RAW264.7 細胞盲傳至第5 代，接種病毒液的細胞與未接毒的細胞相比，在24 h 內(nèi)出現(xiàn)CPE，72 h 內(nèi)CPE 逐漸明顯，主要表現(xiàn)為細胞變圓，變大，接觸抑制消失，而未接毒的細胞逐漸脫落死亡(圖3，見彩插8)。細胞凍融3 次之后，接毒后的細胞培養(yǎng)物經(jīng)RT-PCR 方法，在187 bp 處出現(xiàn)預(yù)期目的條帶，測序結(jié)果顯示與組織樣本擴增測序結(jié)果一致，而未接毒的對照細胞凍融液無目的條帶(圖4)。

圖2 與廣州株(HQ317203)的序列對比結(jié)果Fig.2 Alignment results of DNA fragments with HQ317203

表1 各送檢單位小鼠MNV 的感染情況Tab.1 MNV infection of different tested units

表2 不同品系小鼠MNV 感染情況Tab.2 MNV infection in mice of different strains

圖4 RAW264.7 細胞凍融液RT-PCR 結(jié)果Note:M:DNA marker DL2000;Lane 1-2:inoculated with stool filtrate(72 h);Lane 3:un-inoculated with stool filtrate(72 h);Lane 4:positive control;Lane 5:negative control.Fig.4 RT-PCR results of RAW 264.7 cells freezethaw liquid

3 討論

2003 年，Karst［12］等在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT1)以及重組體激活基因2(RAG2)缺陷(RAG/STAT1－/－)小鼠中首次發(fā)現(xiàn)并分離得到MNV，并將其命名為MNV-1，MNV-1 可以導(dǎo)致RAG/STAT1－/－小鼠發(fā)生致死性感染，病變主要有腦炎、腦膜炎、腦脈管炎、肝炎和肺炎，并且MNV-1在干擾素α、β、γ 受體陰性(IFN-αβγR－/－)小鼠內(nèi)較野生型小鼠內(nèi)表現(xiàn)出更強的毒力，而在免疫功能正常小鼠內(nèi)通常無明顯臨床癥狀。自MNV-1 發(fā)現(xiàn)之后，各地又陸續(xù)分離得到其他多個MNV 毒株，不同的MNV 毒株會導(dǎo)致不同程度的腸道病變及CPE等［13］。

本研究分別采用核酸檢測和血清學(xué)檢測兩種方法對上海地區(qū)實驗動物生產(chǎn)或使用單位送檢的SPF小鼠進行了MNV 自然感染狀況的調(diào)查。結(jié)果顯示各送檢單位小鼠均有MNV 感染，采用RT-PCR 核酸檢測的陽性率為29.78%，ELISA 檢測的血清抗體陽性率為38.89%，由此可見上海地區(qū)實驗小鼠普遍存在MNV 的自然感染，檢測結(jié)果顯示不同品系的實驗小鼠均有陽性結(jié)果檢出，這一方面說明感染的普遍性，另一方面也說明MNV 的感染或許與動物飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)密度等相關(guān)。MNV 屬于RNA 病毒，在自身增殖過程中較易發(fā)生突變，如果突變發(fā)生在與病毒毒力相關(guān)的減毒位點，則容易引起動物的持續(xù)性感染［14］。所以應(yīng)該加強實驗動物飼養(yǎng)管理，及時處理發(fā)生病變或病原感染的實驗動物，保證實驗動物的質(zhì)量。

Hsu［15］建立了一種高通量的新型血清學(xué)檢測方法——流式熒光微球檢測技術(shù)，檢測小鼠血清中MNV 抗體，密蘇里大學(xué)的實驗動物檢測中心從美國和加拿大的研究機構(gòu)送檢的實驗小鼠(n =12639)血清樣本中，經(jīng)復(fù)用熒光免疫測定(Multiplexed fluorescent immunoassay，MFI)測得血清抗MNV-1 抗體陽性率為22.1%。本實驗檢測的319 只實驗小鼠中，有180 只小鼠既采用RT-PCR 擴增，同時又對血清進行了ELISA 檢測，結(jié)果顯示通過RT-PCR 擴增為陽性的有45 只，通過ELISA 檢測為陽性的有70只，兩種檢測方法均顯示為陽性的有34 只。ELISA檢出率比RT-PCR 方法稍高，共同檢出率比單獨檢出率略低，出現(xiàn)這種情況可能與以下因素相關(guān):一是與小鼠感染MNV 的時間、感染量和樣本種類有關(guān)，MNV 屬于腸道病毒，RT-PCR 僅檢測盲腸內(nèi)容物中的病毒核酸。Hsu［15］通過人工灌胃的方法造成10只小鼠感染MNV，分別收集0－7d 的糞便，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第1 天時全部呈現(xiàn)陽性，第7 天時僅有兩只為陽性。也有研究表明小鼠感染MNV 后8 周仍可在糞便中檢測到病毒核酸，感染具有很強的持續(xù)性［10，12］。ELISA 法用于檢測血清抗體，當小鼠感染MNV 后，體內(nèi)抗體的形成需要一定時間，Hsu［10］通過人工灌胃法造成10 只小鼠感染MNV，利用MFI法檢測小鼠血清中MNV 抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第1 周有兩只小鼠處于臨界值范圍，其余8 只呈陰性;第2～5周有7 只處于臨界值或呈陽性。因為兩種檢測方法不同，所檢測的對象不同，所以檢出率會出現(xiàn)一定差異。在感染初期，免疫抗體尚未產(chǎn)生時可以采用RT-PCR 檢測病毒核酸，感染2 周后可以采用ELISA方法檢測血清中的抗體。二是核酸檢測與實驗操作過程緊密相關(guān)，如果糞便樣本處理不當或樣本中病毒量過少，RT-PCR 方法可能出現(xiàn)假陰性。所以兩種方法相結(jié)合可以從一定程度上提高檢出率。另外需要注意的是，免疫缺陷小鼠亦有MNV 病毒核酸和血清抗體陽性的檢出，這或許暗示MNV 感染與機體的免疫系統(tǒng)相關(guān)，有待進一步研究MNV 感染的機制。

袁文等［9］對廣東省實驗小鼠感染MNV 的調(diào)查中，近交系、封閉群、免疫缺陷小鼠的陽性率均在60%以上。本實驗中檢測的實驗小鼠各品系也均存在MNV 感染，卡方檢驗分析MNV 的感染率差異有顯著性，兩種檢測方法結(jié)果顯示ICR 小鼠感染MNV的陽性率最高，免疫缺陷小鼠的陽性率最低(表2)，這可能與免疫缺陷小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境更加嚴格有關(guān)。

CPE 是病毒在細胞內(nèi)增殖及其對細胞產(chǎn)生損害的最明顯表現(xiàn)，不同病毒作用于不同細胞會產(chǎn)生特異性CPE，組織培養(yǎng)細胞內(nèi)CPE 的出現(xiàn)，一般可以認為是病毒增殖的確切證據(jù)，接種物內(nèi)的非特異性毒性物質(zhì)導(dǎo)致的非特異性CPE 在盲傳過程中可消失，而病毒可由于其對細胞培養(yǎng)物的適應(yīng)導(dǎo)致CPE提前出現(xiàn)，病變更明顯［16］。本實驗RAW264.7 細胞接種陽性盲腸內(nèi)容物后，經(jīng)過盲傳至第5 代，細胞在24h 內(nèi)出現(xiàn)CPE，72h 內(nèi)逐漸明顯，與MNV－1 致CPE 表現(xiàn)［17］相似，細胞變圓、變大、接觸抑制消失。同時接種病毒液后的細胞培養(yǎng)物經(jīng)RT－PCR 鑒定得到187bp 的目的條帶，未接種病毒的細胞培養(yǎng)物無目的條帶，說明成功分離到病毒毒株，但為排除其他腸道病原體的存在，需進一步采用蝕斑純化方法，挑取單克隆進行病毒純化。

目前MNV 感染的小鼠對動物實驗有何影響尚無定論，但是國外相關(guān)實驗動物機構(gòu)如Charles River，Harlan 等已越來越重視對實驗小鼠MNV 的監(jiān)測，并已開發(fā)出相應(yīng)的檢測方法。國內(nèi)一些CRO 公司也要求實驗動物檢測機構(gòu)能開展對MNV 的檢測。本文通過對上海地區(qū)MNV 感染狀況的調(diào)查，在一定程度上了解了國內(nèi)MNV 的感染狀況。同時本研究建立的檢測方法可在實驗動物生產(chǎn)單位和使用單位中推廣應(yīng)用，為進一步補充完善實驗動物質(zhì)量控制體系提供技術(shù)支持，促進實驗動物事業(yè)的健康發(fā)展。另外，全世界范圍內(nèi)90%以上的非細菌性胃腸炎是由人諾瓦克病毒(Human Norovirus，HuNV)引起的［12］，由于HuNV 缺乏有效的細胞培養(yǎng)體系及實驗動物模型，無法在體外進行增殖，相關(guān)研究受到限制，而MNV 與HuNV 在基因組大小、結(jié)構(gòu)和功能、病毒粒子大小(直徑28～35 nm)、形狀、浮力密度、致病癥狀以及在自然界的傳播方式(主要通過糞口途徑傳播)等［18］方面有一定的相似性，MNV 可以作為HuNV 的研究模型，通過對MNV 的研究，有助于開展對HuNV 的研究，可以指導(dǎo)治療及預(yù)防HuNV 引起的胃腸炎，減少由HuNV 感染導(dǎo)致的醫(yī)療損失。

(本文圖3 見彩插8)。

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