陳吳健，張明哲，林曉佳，吳 蓉，吳志毅，陳 曦，武 揚(yáng)，吳旭耀

（1.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江杭州 310016；2.杭州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江杭州 310012）

基于ITS序列的菊花花枯病實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法

陳吳健1，張明哲1，林曉佳1，吳 蓉2，吳志毅1，陳 曦1，武 揚(yáng)1，吳旭耀1

（1.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江杭州 310016；2.杭州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江杭州 310012）

根據(jù)菊花花枯病菌與其近似種在ITS序列上的差異，構(gòu)建特異性引物和探針，并用菊花上常見的病害及其近似種進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，供試菌株中僅菊花花枯病菌表現(xiàn)出陽性擴(kuò)增信號，其他菌株和空白對照均未檢測到熒光信號。該法可檢測到100 fg的陽性DNA，完成整個(gè)檢測只需約2 h，可快速、靈敏地完成進(jìn)出境菊花產(chǎn)品中菊花花枯病菌的檢測。

菊花花枯??；實(shí)時(shí)熒光PCR；特異性檢測

菊花花枯?。―idymella ligulicola）是菊花上的重要病害，1982年被列入EPPO（歐洲和地中海植物保護(hù)組織）檢疫性有害生物A2名單中，屬于我國的檢疫性病害。1904年該病在美國北卡羅那州首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道；隨著菊花切花和盆栽菊花的大量生產(chǎn)，為害日益嚴(yán)重，英、德、荷蘭、丹麥、加拿大、肯尼亞、坦桑尼亞、日本、澳大利亞、新西蘭等國均有發(fā)生，我國目前尚無發(fā)生報(bào)道［1］。

該病對環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)，可在各種惡劣的自然條件下發(fā)生，尤其在溫室中常年都可發(fā)病。因此該病一旦定殖，將會(huì)對我國的菊花產(chǎn)業(yè)帶來毀滅性的打擊，即使花費(fèi)大量的人力和財(cái)力，也很難得到根治。鑒于該病危害性嚴(yán)重，適應(yīng)性強(qiáng)，且我國尚無分布，因此加強(qiáng)檢疫是防止該病傳入我國的首要手段。但由于切花產(chǎn)品的特殊性，檢疫周期的長短直接影響著切花產(chǎn)品的品質(zhì)，傳統(tǒng)的檢疫手段耗時(shí)長，難度大，且無法從無癥狀植株上檢出該病，因此篩選出適宜、準(zhǔn)確、快速的檢疫鑒定方法，已成為我國菊花生產(chǎn)及菊花商品進(jìn)出境亟待解決的問題。

本研究根據(jù)菊花花枯病菌與其近似種在ITS序列上的差異，設(shè)計(jì)了特異性的引物和TaqMan-MGB探針，將實(shí)時(shí)熒光PCR方法運(yùn)用于菊花花枯病菌的檢測，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

取菊花常見病害及其近似菌株進(jìn)行試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)菌株Didymella ligulicola從CABI購買；番茄亞隔孢菌從ATCC購買，其余供試菌株均為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定（表1）。

表1 供試菌株的學(xué)名及其寄主

1.2 通用引物和擴(kuò)增程序

課題組根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)菌株提取DNA，用真菌通用引物ITS4和ITS5擴(kuò)增ITS序列，由大連寶生物技術(shù)有限公司合成（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-GG-3'）。擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃熱變性3 min；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，最后72℃延伸7 min［2］。

1.3 特異性引物、探針的設(shè)計(jì)

基于真菌rDNA存在著廣泛的保守區(qū)域，可用作引物的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)存在不同區(qū)域進(jìn)化水平不同的特性，選取菊花花枯病菌rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列，運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫信息和DNASTAR軟件的序列比較分析功能，結(jié)合PCR引物、探針設(shè)計(jì)的原則，設(shè)計(jì)具有菊花花枯病菌特異性的實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針。

1.4 樣品制備

取健康菊花葉片表面洗凈后，分別接種菊花黑斑病病原細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）和鏈格孢（A.alternata），灰霉病病原灰葡萄孢（Botrytis cinerea），白銹病病原堀柄銹菌（Puccinia horiana），菊花花枯病菌（D.ligulicola），25℃保濕培養(yǎng)24 h后，取葉片提取DNA［3］。

1.5 菌株和樣品DNA提取

供試菌株在PDA上培養(yǎng)后，刮取菌絲，液氮研磨后，取0.1～0.2 g備用；剪取有病斑的菊花葉片組織，液氮充分研磨，取0.1～0.2 g，用PROMEGA試劑盒提取DNA。

1.6 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

PCR試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。反應(yīng)體系為20μL，包括10μL 2×Premix Ex Taq、上下游引物（5μmol·L-1）各0.4μL和探針（5μmol·L-1）0.8μL，2μL模板DNA、0.4μL 50×ROX Reference DyeⅡ，加無菌水6μL補(bǔ)至20μL。

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測使用儀器為App lied Biosystems的7500 Fast Real-time PCR System。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：50℃預(yù)熱2 min；95℃變性10 min；95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針

通過Genbank，blast比對，尋找同屬近似種的差異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物DL1和DL2，探針Probe-DL，由于涉及到專利和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)，引物和探針序列在本文中不公開。

2.2 方法特異性檢測

用表1中的菌株對設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果如圖1所示。只有菊花花枯病菌有陽性擴(kuò)增，熒光信號以指數(shù)形式增長，其他菌株均未檢測到熒光信號。說明設(shè)計(jì)的引物和探針對菊花花枯病具有很好的特異性。

圖1 方法特異性的檢測結(jié)果

2.3 方法靈敏度驗(yàn)證

將標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA測定濃度后，按梯度稀釋為1～6個(gè)不同濃度，分別取含有1 ng，100 pg，10 pg，1 pg，100 fg和10 fg的菌絲DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，結(jié)果顯示，1～5梯度的菌絲DNA均能檢測到擴(kuò)增的熒光信號，表現(xiàn)為陽性擴(kuò)增，10 fg的菌絲DNA和陰性對照未檢測到擴(kuò)增信號（圖2）。

結(jié)果表明該檢測方法的檢測靈敏度達(dá)到100 fg的菌絲DNA。

圖2 方法靈敏度的檢測結(jié)果

2.4 菊花樣品的檢測

將1.4節(jié)中制備的樣品DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性對照，健康的菊花葉片作為陰性對照。結(jié)果表明，陽性對照和接種菊花花枯病菌的樣品可見陽性擴(kuò)增曲線，接種其他菌株的樣品和陰性對照無擴(kuò)增信號。說明該法不僅可用來鑒定菊花花枯病菌菌株，也可用于檢測進(jìn)出境菊花產(chǎn)品中是否攜帶菊花花枯病菌（圖3）。

圖3 菊花樣品的檢測結(jié)果

3 小結(jié)和討論

菊花花枯病菌是菊花的毀滅性病害，該病主要侵染菊花花冠，流行快，幾天內(nèi)可使花冠完全腐爛；也可使切花在運(yùn)銷過程中大量落花，給商品菊花造成很大的損失。據(jù)報(bào)道，1975年該病造成了康涅狄格州溫室商品菊花50%以上的損失［4］。為保護(hù)菊花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，我國將菊花花枯病菌列入進(jìn)境檢疫性有害生物名錄，用檢疫手段嚴(yán)防其傳入。

目前，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢疫方法周期長、難度大，已無法滿足當(dāng)今進(jìn)出口貿(mào)易的實(shí)際需求，特別是鮮切花產(chǎn)品，因此分子生物學(xué)方法正在被越來越多地應(yīng)用到進(jìn)出口植物檢疫中。PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR等技術(shù)在油菜莖基潰瘍病、苜蓿黃萎病菌、油棕猝倒病菌等檢疫性真菌病害的鑒定中已得到廣泛應(yīng)用［5-7］，大幅降低了一線檢疫人員的工作強(qiáng)度，縮短了檢測周期，提高了檢出率。

本研究采用標(biāo)準(zhǔn)菌株，通過對其ITS區(qū)序列特征的研究，首次建立了菊花花枯病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測方法，并通過樣品的驗(yàn)證表明，該方法快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)，能夠檢測到100 fg以上的菊花花枯病DNA樣本，整個(gè)檢測過程為2 h左右，能滿足進(jìn)出境菊花及菊花產(chǎn)品快速通關(guān)的要求。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S 432.44

B

0528-9017（2014）11-1695-04

文獻(xiàn)著錄格式：陳吳健，張明哲，林曉佳，等.基于ITS序列的菊花花枯病實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（11）：1695-1698.

2014-06-24

浙江檢疫局重點(diǎn)科技項(xiàng)目（2013ZKZ04）；浙江檢疫局科技項(xiàng)目（ZK201110）

陳吳?。?983-），男，農(nóng)藝師，研究方向?yàn)橹参锊【婢?、線蟲的檢疫鑒定。E-mail：cw j@ziq.gov.cn。