孔令博劉清泉楊 琦高 潔付躍峰

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100700；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010；3中國人民解放軍第306醫(yī)院，北京，100101）

芪歸銀方對抗生素體外抑制多重耐藥銅綠假單胞菌作用的影響

孔令博1劉清泉2楊 琦1高 潔3付躍峰1

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100700；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010；3中國人民解放軍第306醫(yī)院，北京，100101）

目的：探討芪歸銀方含藥血清聯(lián)合抗生素對多重耐藥銅綠假單胞菌的體外抑制作用。方法：運(yùn)用二倍稀釋法檢測單用抗生素、空白血清、含藥血清及血清聯(lián)合抗生素的體外抑菌情況。結(jié)果：空白血清對多重耐藥銅綠假單胞菌無體外抑菌作用，含藥血清則具有明顯的體外抑菌作用；抗生素聯(lián)合含藥血清較單純抗生素和抗生素聯(lián)合空白血清的抑菌情況有明顯差異。結(jié)論：芪歸銀方含藥血清能夠降低抗生素的MIC值、MBC值，提高抑菌率，含藥血清與抗生素具有體外協(xié)同抑菌作用。

芪歸銀方；含藥血清；抗生素；多重耐藥銅綠假單胞菌；體外抑菌

由于第三代頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，近年來多重耐藥和泛耐藥菌株的檢出率不斷增高，銅綠假單胞菌對β-內(nèi)酰胺酶類和碳青霉烯類抗生素的耐藥性明顯增加［1-2］。其在國內(nèi)各大醫(yī)院細(xì)菌分離率調(diào)查中均居于首要位置［3］。眾所周知，抗生素的不合理使用是細(xì)菌耐藥的根源，因此，目前無論是多粘菌素或多種抗生素聯(lián)合應(yīng)用，還是研發(fā)新型抗生素等都不能有效解決細(xì)菌耐藥問題。而近年來的研究證實(shí)了中醫(yī)藥在細(xì)菌耐藥方面極具良好的應(yīng)用前景［4］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明中藥抑菌成分較多，可作用于細(xì)菌的不同部位和繁殖的不同階段，并對細(xì)菌的多個(gè)代謝環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，故不易產(chǎn)生耐藥性［5］。有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以芪歸銀方為對象，研究含藥血清與抗生素的協(xié)同作用，具體如下。

1 材料

1.1 藥物 芪歸銀方（黃芪60 g、當(dāng)歸15 g、金銀花15 g、青蒿10 g、虎杖10 g）提取物（1.0 g/mL），由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥研究室提供；頭孢他啶（深圳致君制藥有限公司，產(chǎn)品批號E20100102）、頭孢哌酮舒巴坦鈉（輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號1039098）、亞胺培南西司他丁鈉（Merck＆Co.，Inc.USA，產(chǎn)品批號100231），均購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥劑科，分別用生理鹽水配制成512μg/mL、512μg/mL（以頭孢哌酮的量計(jì)算）和128μg/mL（以亞胺培南的量計(jì)算）的溶液。

1.2 動(dòng)物 SD大鼠16只，清潔級，體重200～220 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號SCXK-（軍）2007-004。正常光照條件下，食、水可自由攝取，室溫控制在18～22℃之間。

1.3 菌株 多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株1643號，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院細(xì)菌室提供。

1.4 試劑與設(shè)備 M-H瓊脂平板購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司（批號：XWO1100301），立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（ASTELL公司，型號：AMA440N），恒溫培養(yǎng)箱（SAMYO公司，型號：SIMF124），渦混合器（Scientific Industries公司，型號：VORTEX-GENIE 2），低溫高速離心機(jī)（上海愛丁堡生物科技發(fā)展有限公司，型號：Kendro Labofuge 400R），微量天平（METTLER公司，型號：AE100），酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司，型號：DNM-9602）。

2 方法

1）將SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、芪歸銀方組，每組各8只，空白組予蒸餾水，芪歸銀方組給予芪歸銀方提取物灌胃，均為每日兩次，每次2 m L，共5d，末次給藥后1 h，將各組大鼠予10%水合氯醛溶液，按0.4 mL/100 g，腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，4℃離心，2500r/min，20 min，無菌分離血清，將各組8只大鼠血清混合后，56～60℃水浴30 min，進(jìn)行滅活。

2）在24孔板中分別依次加入0.8 mL、0.4 mL、0.3 mL、0.2 mL、0.1 mL的空白血清和含藥血清，然后用M-H肉湯培養(yǎng)基將各孔補(bǔ)至1 mL，再將含液體培養(yǎng)基的菌液（5×107CFU/mL）取10μL加入各孔中，37℃，孵育18～24 h。然后分別轉(zhuǎn)種至含有M-H瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，37℃，孵育18～24 h。

3）在24孔板中加入M-H肉湯培養(yǎng)基1 m L，再分別于每組的第一個(gè)空加入頭孢他啶溶液、頭孢哌酮舒巴坦鈉溶液、亞胺培南西司他丁鈉溶液，采用二倍稀釋法將各孔依次對倍稀釋，最終每個(gè)反應(yīng)體系均為1 mL，再將含液體培養(yǎng)基的菌液（5×107CFU/mL）取10 μL加入各孔中，37℃，孵育18～24 h。然后分別轉(zhuǎn)種至含有M-H瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，37℃，孵育18～24 h。

4）在24孔板中加入M-H肉湯培養(yǎng)基0.5 m L，再分別于每組的第一個(gè)孔加入頭孢他啶溶液、頭孢哌酮舒巴坦鈉溶液、亞胺培南西司他丁鈉溶液0.5 mL，采用二倍稀釋法將各孔依次對倍稀釋，每個(gè)反應(yīng)體系均為0.5 mL，再向每個(gè)孔加入M-H肉湯培養(yǎng)基0.3 mL和滅活后的兩種血清0.2 mL，最終每個(gè)反應(yīng)體系均為1 mL，其中血清的含量均為20%，然后將含液體培養(yǎng)基的菌液（5×107CFU/mL）取10μl加入各孔中，37℃，孵育18～24 h。然后分別轉(zhuǎn)種至培養(yǎng)皿，37℃，孵育18～24 h。

3 結(jié)果

1）空白血清和給予大鼠等效劑量芪歸銀方提取物灌胃后得到的含藥血清在反應(yīng)體系中占80%時(shí)，仍無體外抑菌作用。見表1。

表1 空白血清和含藥血清對多重耐藥銅綠假單胞菌的抑菌作用

2）單純頭孢他啶MIC值為64μg/mL，聯(lián)合空白血清后MIC值仍為64μg/m L，聯(lián)合含藥血清后其MIC值降為32μg/mL；單純頭孢哌酮舒巴坦鈉MIC值為64μg/m L、MBC值為256μg/mL，聯(lián)合空白血清后其MIC值無變化，聯(lián)合含藥血清后其MIC值和MBC值均有明顯下降；單純亞胺培南西司他丁鈉MIC值為32 μg/mL，聯(lián)合空白血清后其MIC值和MBC值變化不明顯，聯(lián)合含藥血清后其MIC值降至8μg/m L，MBC值為16μg/mL。見表2。

表2 單純抗生素與抗生素聯(lián)合血清對多重耐藥銅綠假單胞菌的MIC、MBC值

表3 相同抗生素濃度下單純抗生素與抗生素聯(lián)合血清對多重耐藥銅綠假單胞菌的抑菌率

3）將24孔板中各反應(yīng)體系用加樣器取20μL加至96孔板中，每個(gè)反應(yīng)體系3個(gè)副孔，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測各孔樣本570 nm的OD值，求平均值，得出抑菌率。結(jié)果表明，在同一抗生素濃度下，抗生素聯(lián)合含藥血清組的抑菌率均明顯高于單純抗生素組和抗生素聯(lián)合空白血清組。見表3、圖1。

圖1 相同抗生素濃度下單純抗生素與抗生素聯(lián)合血清對多重耐藥銅綠假單胞菌的抑菌率趨勢圖

4）經(jīng)東直門醫(yī)院細(xì)菌室菌種鑒定，各組均為銅綠假單胞菌；藥敏結(jié)果顯示，含藥血清組和亞胺培南西司他丁鈉+含藥血清組轉(zhuǎn)種后的銅綠假單胞菌對頭孢哌酮舒巴坦鈉耐藥性為中介，MIC值為32μg/mL，對其他抗生素耐藥。其余各組轉(zhuǎn)種后的銅綠假單胞菌對藥敏試驗(yàn)所用抗生素均耐藥，與實(shí)驗(yàn)菌株的藥敏結(jié)果一致。

4 討論

銅綠假單胞菌（PA）具有較強(qiáng)的快速適應(yīng)能力，其產(chǎn)生多重耐藥性的機(jī)制復(fù)雜，對某一類抗菌藥物的耐藥往往是幾種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果，對不同抗菌藥物的耐藥機(jī)制也不完全相同，而且還不斷有新的耐藥機(jī)制出現(xiàn)，目前已知的耐藥機(jī)制主要有［6］：1）產(chǎn)生純化酶，如β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類修飾酶等；2）基因突變，如DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶及DNA回旋酶突變、主動(dòng)外排泵系統(tǒng)的過量表達(dá)等；3）生物被膜；4）DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)。

基于中醫(yī)藥抗感染的歷史經(jīng)驗(yàn)和優(yōu)勢，近年來在中醫(yī)藥治療耐藥菌感染方面已有一些研究。夏金堯等［7］研究證實(shí)滇產(chǎn)五倍子、白芍等9種中草藥對產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥大腸埃希菌具抑菌作用，對標(biāo)準(zhǔn)菌抗菌活性較大的提取物對耐藥菌也具有較大的抗菌活性。肖洋等［8］研究結(jié)果表明五倍子提取液對銅綠假單胞菌R質(zhì)粒具有較好的消除作用。席清平等［9］研究顯示五倍子可抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性，抑制葡聚糖生成，從而阻止生物膜形成。上述研究表明中藥具有抑制耐藥菌的作用，并能針對某些耐藥機(jī)制逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性，為中醫(yī)藥有效治療耐藥菌感染提供有力的依據(jù)，但是目前對中藥與抗生素之間的聯(lián)合作用研究較少。毋庸置疑，抗生素的殺菌、抑菌效果無可比擬，中藥遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也可以看出，提高頭孢哌酮舒巴坦鈉和亞胺培南西司他丁鈉的濃度后二者還是能夠起到對多重耐藥銅綠假單胞菌1643號菌株的抑菌作用，但是，臨床上不可能為了達(dá)到抗生素的抑菌作用而無限制地提高抗生素的劑量。因此，本實(shí)驗(yàn)以芪歸銀方和抗生素是否存在協(xié)同抑菌作用為研究對象，觀察含藥血清聯(lián)合抗生素的體外協(xié)同抑菌作用，其結(jié)果顯示頭孢他啶、頭孢哌酮舒巴坦鈉和亞胺培南西司他丁鈉三種抗生素聯(lián)合芪歸銀方含藥血清與單用抗生素體外抑菌效果有明顯的差異，含藥血清能夠有效降低上述三種抗生素的MIC、MBC值，提高抗生素的抑菌率，增強(qiáng)其抑菌、殺菌作用，為芪歸銀方聯(lián)合抗生素有效治療多重耐藥菌感染提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。提示芪歸銀方含藥血清可能能夠作為抗生素的“增敏劑”，降低耐藥菌對抗生素的耐藥程度，從而增強(qiáng)抗生素的療效，減少抗生素的使用，縮短抗生素的使用時(shí)間。值得注意的是，藥敏結(jié)果顯示含藥血清組和亞胺培南西司他丁鈉+含藥血清組轉(zhuǎn)種后的銅綠假單胞菌對頭孢哌酮舒巴坦鈉耐藥性為中介，MIC值為32μg/mL，提示芪歸銀方含藥血清可能能夠逆轉(zhuǎn)耐藥菌的耐藥性，使其對原本耐藥的抗生素重新恢復(fù)敏感。本課題組相關(guān)研究亦證實(shí)了這種可能性的存在，即芪歸銀方含藥血清對β-內(nèi)酰胺酶水解具有明顯的抑制作用［10］，凸顯了其解決細(xì)菌耐藥這一棘手難題的潛力。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)所用芪歸銀方，選用黃芪、當(dāng)歸補(bǔ)氣養(yǎng)血以扶正，金銀花、青蒿、虎杖清熱解毒以透邪，組方切合耐藥菌感染正虛邪伏的中醫(yī)病機(jī)［11］，具有通過調(diào)節(jié)感染引起的炎癥反應(yīng)和免疫紊亂達(dá)到增強(qiáng)臨床抗耐藥菌感染療效的潛力與優(yōu)勢，值得進(jìn)一步研究。

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（2014-02-17收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）

Study on the Effect of Qiguiyin Decoction and Antibiotics Inhibiting Multi-drug Resistant Pseudomonas Aeruginosa in Vitro

Kong Lingbo1，Liu Qingquan2，Yang Qi1，Gao Jie3，F(xiàn)u Yuefeng1
（1 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China；2 Beijing Chinese Medicine Hospital，Capital Medical University，Beijing 100010，China；3 306 Hospital of People's Liberation Army，Beijing 100101，China）

Objective：To explore the bacteriostasis effect of Qiguiyin decoction combined with antibiotics inhibiting multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa in vitro.Methods：The antibacterial situation of antibiotics，blank serum，Qiguiyin decoction-containing serum and Qiguiyin decoction＆antibiotics-containing serum in vitro were detected with double dilution method.Results：Blank serum had no effect of bacteriostasis on multi-drug resistant PA，while Qiguiyin decoction-containing serum had significant effect of bacteriostasis on it，and there was significant difference between them.Besides，the serum with both Qiguiyin decoction and antibiotics showed more significant bacteriostasis effect.Conclusion：Qiguiyin decoction-containing serum could reduce the content of MIC，MBC in antibiotics and increase the bacteriostasis rate.Qiguiyin Decoction-containing serum and antibiotics have significant cooperation effect of bacteriostasis on PA in vitro.

Qiguiyin decoction；Qiguiyin decoction-containing serum；Antibiotics；Multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa；Bacteriostasis in vitro

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.03.007

國家“十一五”科技重大專項(xiàng)（編號：2009ZX09103-415）；國家“十二五”科技重大專項(xiàng)（編號：2013ZX09102026）；中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)（編號：200907001）

劉清泉，E-mail：liuqingquan2003＠126.com，電話：（010）52176766