趙 光 李 珺* 陳超陽

葡萄酒中抗癌活性成分反式白藜蘆醇含量及其環(huán)境因素的影響*

趙 光①李 珺①*陳超陽①

目的：利用高效液相色譜法測定葡萄酒中抗癌活性成分反式白藜蘆醇的含量，并研究其含量的環(huán)境影響因素。方法：采用高效液相色譜法，使用ZORBAX C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為30%乙腈水溶液；流速為1 ml/min；檢測波長為306 nm；柱溫為室溫；分離測定葡萄酒中反式白藜蘆醇的含量，并研究光照、溫度及密封狀況對其含量的影響。結(jié)果：張裕干紅葡萄酒中反式白藜蘆醇的含量為(1.01±0.03)mg/L，長城干紅解百納中反式白藜蘆醇的含量為(2.36±0.02)mg/L。陽光照射、溫度升高及密封狀況差均會導(dǎo)致反式白藜蘆醇含量下降。結(jié)論：不同品牌的葡萄酒中反式白藜蘆醇含量相差較大，且應(yīng)在低溫、避光和密封的條件下貯存葡萄酒。

葡萄酒；高效液相色譜法；反式白藜蘆醇

[First-author’s address]School of Chemical Biology and Phamaceutical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China.

白藜蘆醇(Resveratrol)又稱芪三酚，化學(xué)名稱為3，4’，5-三羥基-1，2-二苯乙烯(3-4’-5 -trihydroxystilbene)，是一種非黃酮類多酚化合物，為無色、無味針狀結(jié)晶，難溶于水，易溶于有機溶劑[1]。天然的白藜蘆醇有順、反兩種結(jié)構(gòu)，自然界中白藜蘆醇主要以反式構(gòu)象存在，反式異構(gòu)體的生物活性強于順式。白藜蘆醇可以與葡萄糖結(jié)合形成順式和反式白藜蘆醇糖苷，白藜蘆醇糖苷在腸道中糖苷酶的作用下可以釋放出白藜蘆醇。

白藜蘆醇是一種重要的植物抗毒素，具有抗腫瘤、心血管保護、抗自由基、抗氧化及抗炎等廣泛的生物活性[2]。白藜蘆醇可以通過阻止調(diào)節(jié)性T細胞的抑制作用來進行抗氧化、抗炎，從而對抗高脂食物引起的肥胖癥[3]。最近的研究表明，白藜蘆醇可以通過調(diào)節(jié)肝臟的ATP含量，從而發(fā)揮其生物活性[4]。白藜蘆醇抗腫瘤的作用得到了廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對肺癌、肝癌、前列腺癌及乳腺癌等多種腫瘤具有顯著抗瘤效應(yīng)[5]。白藜蘆醇抗腫瘤是一個多因素參與的復(fù)雜過程，可以通過抗氧化、抑制環(huán)氧化酶(COX)促進腫瘤細胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化等來發(fā)揮作用。近年來研究證實，白藜蘆醇對細胞色素P450各亞型的活性也有不同程度影響[6]。白藜蘆醇對血小板與黑色素瘤細胞黏附也有抑制作用，從而影響腫瘤細胞生物學(xué)惡性行為，抑制腫瘤細胞體外轉(zhuǎn)移[7]。

白藜蘆醇可以通過人工方法合成類似物，也可以從天然植物中提取，藜蘆、決明、虎杖、葡萄、桑子、花生、鳳梨、買麻藤以及朝鮮槐等70余種植物中含白藜蘆醇及其甙類。其中葡萄中含的白藜蘆醇較高，用于抵御真菌、紫外線等逆境脅[8-10]。人體適量地飲用葡萄產(chǎn)品，如葡萄酒、葡萄提取物等對身體健康有幫助，有益于人體的免疫機能[11-12]。

葡萄酒中的白藜蘆醇含量受環(huán)境因素影響，植物的不同部位、不同產(chǎn)地和品種的葡萄酒樣品中的白藜蘆醇含量也會不同[13]。由于釀酒葡萄中存在白藜蘆醇，因其在釀造過程中會引入葡萄酒中而備受關(guān)注。有關(guān)葡萄及葡萄酒中白藜蘆醇的含量分析以及分析方法也有較多的研究，而對影響白藜蘆醇在釀酒葡萄及葡萄酒中含量的因素研究較少[14]。

白藜蘆醇提取方法主要有溶劑提取、酶法提取、超臨界流體萃取、超聲波輔助提取以及微波輔助提取等；白藜蘆醇的檢測有高效液相色譜法、氣相色譜法、色譜—質(zhì)譜法、毛細管電泳法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法及電化學(xué)方法等[15]。高效液相色譜法作為經(jīng)典的方法，用于葡萄酒中白藜蘆醇含量檢測更具有普適性，通過對相關(guān)的成分進行檢測，并分析影響因素，進一步研究和作為質(zhì)量評價標準，有良好的開發(fā)前景[16]。本研究建立葡萄酒中白藜蘆醇含量的高效液相色譜檢測方法，分析了不同產(chǎn)區(qū)釀制的葡萄酒中的白藜蘆醇含量，并分析影響葡萄酒中白藜蘆醇含量的一些因素。

1 材料及方法

1.1 儀器與試劑

(1)美國Agilent 1100高效液相色譜儀，ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA CCA-1111冷阱。

(2)甲醇(色譜純，F(xiàn)isher)，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)，乙酸乙酯為國藥集團化學(xué)試劑有限公司出品，反式白藜蘆醇標準品為南京澤郎公司出品，張裕干紅葡萄酒(赤霞珠，標準號：GB15037)，長城星級干紅葡萄酒(解百納，標準號：GB15037-2006)。

1.2 樣品制備

取葡萄酒400 ml，使用600 ml乙酸乙酯提取后用體積分數(shù)為3%的碳酸氫鈉溶液洗滌，重蒸水洗滌至溶液為中性，無水硫酸鈉脫水，溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，殘留物用40 ml乙腈溶解后待用。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為30%的乙腈和70%的水；流速為1 ml/ min；進樣量為20 μl；柱溫為室溫；檢測波長為306 nm。

1.4 陽光照射對白藜蘆醇含量的影響

將葡萄酒供試品平均分為A、B兩組，A組密封避光保存，B組密封于自然光源下保存。保持其他因素相同，葡萄酒樣品于0 h、1 h和2 h后提取濃縮測定反式白藜蘆醇含量。以A組樣品為對照，研究光照對B組樣品中反式白藜蘆醇的含量是否有影響。

1.5 貯藏溫度對白藜蘆醇含量的影響

將葡萄酒平均分為A、B、C三個組，模擬日常的貯藏條件，將其分別避光密封貯藏于4 ℃(冰箱溫度)、20 ℃(正常室溫)、40 ℃(夏季較高室溫)環(huán)境中。恒溫6 h后分別測定各組中反式白藜蘆醇的含量，研究貯藏溫度對反式白藜蘆醇的含量是否有影響。

1.6 密封狀況對白藜蘆醇含量的影響

將葡萄酒平均分為A、B兩組，A組避光密封于陰涼處儲存，B組避光開蓋于陰涼處儲存，保持其他條件相同，分別在24 h、48 h和72 h后測定其反式白藜蘆醇的含量，研究密封狀況對反式白藜蘆醇的含量是否有影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析

在選定的色譜條件下，測得反式白藜蘆醇標準品的色譜圖(如圖1所示)，標準品保留時間為8 min。測得樣品的色譜圖如圖2所示。

圖1 反式白藜蘆醇標準品HPLC色譜圖

圖2 葡萄酒樣品HPLC色譜圖

2.2 線性關(guān)系

精密稱取反式白藜蘆醇標樣4.00 mg，用乙腈溶解并定容至50 ml，配成濃度水平為80.00 mg/L的標準溶液。將其逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為40.00 mg/ L、20.00 mg/L、10.00 mg/L、5.00 mg/L、2.50 mg/L的標準溶液(因葡萄酒濃縮10倍后進行反式白藜蘆醇含量測定，故配制的標準液質(zhì)量濃度應(yīng)相應(yīng)增大10倍)[4-7]。每個濃度進樣20 μl，在上述色譜條件下分析，以峰面積平均值對相對應(yīng)的質(zhì)量濃度建立回歸方程。以相應(yīng)峰面積Y對其進樣濃度X(mg/L)進行線性回歸，得線性方程為：Y＝167.36722X-213.24955(r＝0.999)。線性關(guān)系在2.50～80.00 mg/L時為良好。

2.3 精密度

取葡萄酒樣品溶液重復(fù)進樣并測定6次，計算其精密度相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為1.73%，表明反式白藜蘆醇在樣品中較為穩(wěn)定。

2.4 回收率

精確量取反式白藜蘆醇質(zhì)量濃度已測定的葡萄酒濃縮液3份，每份1 ml，分別向其中加入反式白藜蘆醇標準液(20.00 mg/L)1 ml、2 ml和3 ml作供試品溶液。搖勻進樣，每組測3次。測定加樣后溶液中反式白藜蘆醇的質(zhì)量濃度與加樣前溶液中反式白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，測得葡萄酒中反式白藜蘆醇的加樣回收率平均值為21.90 mg/L，RSD值為4.78%。

2.5 樣品含量測定

取兩種市售葡萄酒樣品(張裕干紅葡萄酒、長城干紅解百納)濃縮后分別進樣20 μl，各平行重復(fù)測定3次，求其峰面積的平均值，并通過回歸方程計算出反式白藜蘆醇的質(zhì)量濃度。測得張裕干紅葡萄酒中反式白藜蘆醇含量為1.01 mg/L，RSD值為0.03%；長城干紅解百納葡萄酒中反式白藜蘆醇含量為2.36 mg/ L，RSD值為0.02%。

2.6 陽光照射對白藜蘆醇含量的影響

將A、B兩組長城干紅解百納供試品分別以避光、光照方式貯藏0 h、1 h和2 h后觀察其含量的變化情況(見表1)。

表1 光照對反式白藜蘆醇含量的影響(mg/L)

2.7 貯藏溫度對白藜蘆醇含量的影響

A、B、C三個不同溫度組別于6 h后在長城干紅解百納葡萄酒中的反式白藜蘆醇的含量見表2。

表2 貯藏溫度對反式白藜蘆醇含量的影響(mg/L)

2.8 密封狀況對白藜蘆醇含量的影響

A、B兩組長城干紅解百納葡萄酒樣品放置24 h、48 h和72 h后對應(yīng)的含量見表3。

表3 密封狀況對中反式白藜蘆醇含量的影響(mg/L)

3 討論

葡萄酒中白藜蘆醇的含量低，難于檢測。將葡萄酒提取濃縮10倍后進行測定，去除其他成分后反式白藜蘆醇峰非常明顯，故采用提取濃縮后進樣的方式對反式白藜蘆醇進行測定。測得張裕干紅葡萄酒中反式白藜蘆醇含量為1.01 mg/L(RSD值為0.03%)；長城干紅解百納葡萄酒中反式白藜蘆醇含量為2.36 mg/ L(RSD值為0.02%)。實驗表明，本研究所建立的葡萄酒中反式白藜蘆醇含量測定方法準確可靠、重復(fù)性好、回收率高。而不同品牌的葡萄酒中反式白藜蘆醇的含量有較大差異。長城干紅解百納葡萄酒中反式白藜蘆醇的濃度較高。

在光照對葡萄酒中反式白藜蘆醇含量的影響研究中，貯存1 h、2 h后，B組葡萄酒樣品中反式白藜蘆醇的含量均顯著性低于A組。光照使葡萄酒中反式白藜蘆醇含量下降可能是由反式白藜蘆醇發(fā)生轉(zhuǎn)化或降解所致。在溫度對葡萄酒中反式白藜蘆醇含量影響的研究中，將葡萄酒放置6 h后A、B、C三組葡萄汁樣品中反式白藜蘆醇的含量也呈遞減趨勢，推斷其含量差異是由貯藏溫度所導(dǎo)致，即反式白藜蘆醇的含量隨溫度升高而下降。在密封狀況對葡萄酒中反式白藜蘆醇含量的影響研究中其結(jié)果表明，密封狀況對反式白藜蘆醇的含量有影響，密封條件差可導(dǎo)致反式白藜蘆醇含量下降。因此，不同的外界環(huán)境因素會影響葡萄酒中反式白藜蘆醇的含量，為減少反式白藜蘆醇的損失，葡萄飲品應(yīng)嚴格在避光、密封和低溫環(huán)境中貯存。

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Research on anti-cancer active component in red wine

ZHAO Guang, LI Jun, CHEN Chao-yang// China Medical Equipment,2014,11(3):4-7.

Objective: To detect the anti-cancer component, trans-resveratrol in red wine by high performance liquid chromatography, and to determine the influence of environmental factors on its content.Methods: A method for determining trans-resveratrol in red wine by HPLC is described. The operating conditions were ZORBAX-C18column(4.6 mm×250 mm, 5 μm) at room temperature, 30% acetonitrile as mobile phase at a flow of 1 ml/min and UV detection at 306 nm.Results: The content of trans-resveratrol in Changyu dry red wine and Great Wall Claret Cabernet are (1.01±0.03) mg/L and (2.36±0.02) mg/L, respectively. The results show that, sunlight, high temperature and poor seal condition can decrease the content of trans-resveratrol.Conclusion: The content of transresveratrol varies in different brands of red wine. Red wine should be stored in cool, dark and sealed conditions.

Red win; HPLC; Trans-resveratrol

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.03.002

1672-8270(2014)03-0004-04

R914

A

2013-11-18

國家自然科學(xué)基金(30500648)“以FAS為靶從元寶楓發(fā)展無耐藥性的抗腫瘤藥物”；北京市自然科學(xué)基金(7103168)“以介孔材料為載體從天然產(chǎn)物發(fā)展抗腫瘤靶向給藥系統(tǒng)”；北京市教育委員會科技發(fā)展計劃面上項目(KM201010025011)“從虎杖等天然產(chǎn)物中發(fā)展腫瘤化學(xué)預(yù)防藥物”；首都中醫(yī)藥研究專項(ZM02)“醫(yī)院制劑抗瘤丸治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用機理研究”

①首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院 北京 100069

*通訊作者：lijun88@ccmu.edu.cn

趙光,女,(1961- ),碩士，副教授。首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院，從事醫(yī)藥化學(xué)教學(xué)與天然藥物科研工作。