王 蓉

（浙江理工大學(xué)，浙江杭州 310018）

快速敲除補回家蠶核型多角體病毒ORF29

王 蓉

（浙江理工大學(xué)，浙江杭州 310018）

利用Red重組系統(tǒng)成功敲除家蠶核型多角體病毒ORF29基因（BmNPV ORF29，簡稱Bm29），并利用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建補回型的Bm29基因。通過PCR鑒定敲除和補回均成功，為后續(xù)的Bm29基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

家蠶核型多角體病毒；ORF29基因；Red重組；Bac-to-Bac

桿狀病毒是已知昆蟲病毒中類群最大，且具有較大實用意義的昆蟲病毒［1］。目前，已有29種昆蟲桿狀病毒的基因組被完全測序［2］。

基因敲除技術(shù)是研究基因功能的一種常用手段。傳統(tǒng)的構(gòu)建重組桿狀病毒方法是利用轉(zhuǎn)移載體與野生型病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，通過同源交換和空斑純化獲得重組病毒，但該方法不僅重組效率低，而且耗時耗材［3］。近年來，Red重組系統(tǒng)，因其準(zhǔn)確率高、操作簡便的優(yōu)點逐漸成為新型的基因敲除方法［4］。Red重組系統(tǒng)屬于λ噬菌體的重組系統(tǒng)，它的編碼基因exo，bet和gam置于L-阿拉伯糖啟動子控制下，在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)下能夠表達(dá)重組所需的酶，從而介導(dǎo)線性化片段與染色體的特定片段進(jìn)行同源重組，進(jìn)而利用外源基因替換靶基因［5］。目前，已經(jīng)有報道利用Red重組成功敲除了桿狀病毒基因lef-6，l ef-8和lef-10［6-8］。

家蠶核型多角體病毒（BmNPV）基因組已經(jīng)被測序完全，含有136個完整的開放閱讀框［9］。BmNPVORF29，簡稱Bm29，全長654 bp，位于BmNPV基因組T3株的26449～27102 bp處，表達(dá)產(chǎn)物預(yù)測分子量為22.0 ku。該基因功能的研究還一直未見報道，本文首次利用Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌中成功地對Bm29基因進(jìn)行了定點敲除，并利用Bac-to-Bac系統(tǒng)補回缺失型的Bm29基因，為后續(xù)基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BW 25113-Bac、E.coli TG1和DH10Bac菌種，質(zhì)粒pFastBac1、pKD3和pKD46均由本實驗室保存。

Taq酶、限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ，T4 Ligation，DL2000，1 kb DNA Marker購于TaKaRa公司；L-阿拉伯糖購自美國Promega公司；凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；引物合成、測序由Invitrogen公司完成；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 Bm29基因的敲除型的構(gòu)建

PCR制備Bm29基因打靶線性化片段。以pKD3質(zhì)粒為模板，引物由50 bp的Bm29基因的同源臂（下劃線為同源臂）和20 bp的cat的同源區(qū)組成，如下：Bm29-C-F3'）。PCR擴增獲得1 100 bp左右的打靶片段，命名為Bm29-C。

將純化后的Bm29-C轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞（含pKD46質(zhì)粒）中，加入L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)表達(dá)λRed，使得Bm29-C與病毒基因組中的Bm29基因發(fā)生同源重組。進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并做PCR、雙酶切鑒定和測序（圖1）。

為了驗證Bm29基因是否被敲除，用不同的引物組合進(jìn)行PCR鑒定。所用的驗證引物分別為Bm29-F（5'-CGCTGCAGGATTGTTTATGA-3'）和Bm29-R（5'-TTACACCCGCCTAAGTGCGTGC-3'）、Bm29-F和cat-R（5'-CAATATGGACAACTTCTTCG-3'）、cat-F（5'-CAATATGGACAACTTCTTCG-3'）和Bm29-R。

圖1 Bm29基因敲除型構(gòu)建策略

1.2.2 Bm29基因的補回型的構(gòu)建

將Bm29基因補回至Bm29-KO-Bacmid中，需構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac1-Bm29，并利用Bac-to-Bac系統(tǒng)將Bm29基因異位補回到多角體啟動子下（圖2）。

圖2 Bm29基因補回型構(gòu)建策略

根據(jù)Bm29基因的序列并在上下游插入酶切位點Eco RⅠ和Bam HⅠ，來設(shè)計引物。引物分別pFB-Bm29-R線為酶切位點Eco RⅠ）及pFB-Bm29-F（5'-為酶切位點Bam HⅠ）。以wtBacmid為模板，pFBBm29-F和pFB-Bm29-R為引物進(jìn)行PCR擴增。純化后的PCR產(chǎn)物與載體pFastBac 1分別用EcoRⅠ和Bam HⅠ進(jìn)行雙酶切。連接產(chǎn)物，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。對重組質(zhì)粒pFastBac1-Bm29進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，并測序。將重組成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞（Bm29缺失型病毒）中，Bm29基因重新補回Bm29-KO-Bacmid中，獲得補回型Bm29-Re-Bacmid。

為了鑒定是否成功補回，利用M13和Bm29基因特異性引物對Bm29-KO-Bacmid和Bm29-Re-Bacmid進(jìn)行PCR，引物組合分別為M13-F（5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'）和M13-R（5'-CAGGAAA CAGCTATGAC-3'）、M13-F和pFB-Bm29-R、PFBBM29-F和M13-R。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定Bm29基因的敲除

PCR鑒定Bm29基因是否敲除成功，結(jié)果如圖3。結(jié)果顯示Bm29-F和Bm29-R為引物的擴增產(chǎn)物大小約為1 600 bp；Bm29-F和cat-R為引物的擴增產(chǎn)物大小約為460 bp；cat-F和Bm29-R為引物的擴增產(chǎn)物大小約為1 100 bp；以上結(jié)果表明已成功將Bm29基因從Bcmid基因組中敲除。

圖3 敲除Bm29的PCR鑒定

2.2 鑒定Bm29基因的補回

圖4 補回型Bm29的PCR鑒定

PCR鑒定Bm29基因是否正確補回。結(jié)果如圖4。以M13-F和M13-R為引物的擴增產(chǎn)物大小約為2 300 bp；以M13-F和pFB-Bm29-R為引物的擴增產(chǎn)物大小約為3 000 bp；以pFB-Bm29-F和M13-R為引物的擴增產(chǎn)物大小約1 360 bp，均與理論值相符。表明Bm29基因已成功補回。

3 小結(jié)和討論

研究桿狀病毒基因的功能需要將目的基因失活，利用Red重組系統(tǒng)［10-14］只要50 bp左右的同源臂即可介導(dǎo)外源基因與目的基因發(fā)生同源重組。這種方法不需要體外酶切反應(yīng)，也不存在其他堿基突變的危險，是一個簡單、快速、高效的基因敲除系統(tǒng)［15］。

本文利用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建補回型病毒，通過PCR鑒定敲除和補回型的Bm29基因，為后續(xù)的基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

［1］ 郭忠建，姚勤，王海燕，等.利用Red系統(tǒng)快速敲除家蠶核型多角體病毒orf60基因［J］.生物工程學(xué)報，2007，23（5）：801-805.

［2］ Jehle JA，Blissard G，Bonning B，et al.On the classification and nomenclature of baculoviruses：a proposal for revision［J］. Archives of Virology，2006，151（7）：1257-1266.

［3］ O'Reilly D R，M iller L K，Luckow V A.Baculovirus expression vectors：a laboratory manual［M］.New York：Oxford University Press，1994.

［4］ 張雪，溫廷益.Red重組系統(tǒng)用于大腸桿菌基因修飾研究進(jìn)展［J］.中國生物工程雜志，2008，28（12）：89-93.

［5］ 李樊，劉義，何鋼.基因敲除技術(shù)研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報，2008（2）：80-82.

［6］ Lin G，Blissard G W.Analysis of an Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus lef-6-null virus：LEF-6 is not essen tial for viral replication bu t appears to accelerate late gene transcription［J］.Journal of Virology，2002，76（11）：5503-5514.

［7］ Acharya A，Gopinathan K P.Characterization of late gene expression factors lef-9 and lef-8 from Bombyx mori nucleopolyhedrovirus［J］.Journal of General Virology，2002，83（8）：2015-2023.

［8］ Yu W，Du C Y，Quan Y P，et al.Characterization of late gene expression factor LEF-10 from Bombyx mori nucleopolyhedrovirus［J］.Virus Research，2013，175（1）：45-51.

［9］ Gomi S，Majima K，Maeda S.Sequence analysis of the genome of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus［J］.Journal of General Virology，1999，80（5）：1323-1337.

［10］ Passarelli A L，Guarino L A.Baculovirus late and very late gene regulation［J］.Current Drug Targets，2007，8（10）：1103-1115.

［11］ Gomi S，Majima K，Maeda S.Sequence analysis of the genome of Bombyxmori nucleopolyhedrovirus［J］.Journal of General Virology，1999，80（5）：1323-1337.

［12］ Vanarsdall A L，Okano K，Rohrmann G F.Characterization of the replication of a baculovirus mutant lacking the DNA polymerase gene［J］.Virology，2005，331（1）：175-180.

［13］ Vanarsdall A L，Okano K，Rohrmann G F.Characterization of a baculoviruswith a deletion of vlf-1［J］.Virology，2004，326（1）：191-201.

［14］ Datsenko K A，Wanner B L.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，2000，97（12）：6640-6645.

［15］ 王軍平，張友明.Red/ET重組及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［J］.生物工程學(xué)報，2005，21（3）：502-506.

（責(zé)任編輯：張 韻）

S 884.5

：A

：0528-9017（2014）10-1624-03

文獻(xiàn)著錄格式：王蓉.快速敲除補回家蠶核型多角體病毒ORF29［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（10）：1624-1626.

2014-08-21

王 蓉（1989-），女，安徽當(dāng)涂人，碩士研究生，主要從事基因表達(dá)與調(diào)控研究工作。E-mail：wangrong_8912 @163.com。