齊亞軍 劉 健 鄭 力 萬(wàn) 磊 曹云祥 孫 玥 王 芳(安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，合肥230038)

基于Keap1-Nrf2-ARE探討強(qiáng)直性脊柱炎患者心功能降低的機(jī)制①

齊亞軍 劉 ?、卩?力③萬(wàn) 磊②曹云祥②孫 玥 王 芳(安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，合肥230038)

目的:基于Keap1-Nrf2-ARE通路探討強(qiáng)直性脊柱炎(AS)患者心功能降低的機(jī)制。方法:隨機(jī)選取140例AS患者作為研究組，并抽取60例健康人作為正常對(duì)照組;采用多普勒超聲心動(dòng)圖(UCG)檢測(cè)兩組心功能參數(shù)[E峰、A峰、E/A比值、左心房舒張期內(nèi)徑(LADd)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左心室短軸縮短率(FS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)、每搏輸出量(SV)];采用ELISA法檢測(cè)兩組血清中通路蛋白[Keap1樣ECH相關(guān)蛋白l(Keap1)、核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)]、氧化應(yīng)激指標(biāo)[丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(TAOC)]和細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10)含量;采用魏氏法檢測(cè)炎性指標(biāo)血沉(ESR);采用日立7060型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(CRP)、免疫球蛋白。結(jié)果:(1)與正常對(duì)照組相比，AS活動(dòng)期心功能參數(shù)(E峰、EF、E/A 值)、抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或 P＜0.05);心功能參數(shù) A 峰、通路蛋白(Keap1、Nrf2 值)、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指標(biāo)(ESR、CRP)值顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)。(2)與正常對(duì)照組相比，AS穩(wěn)定期心功能參數(shù)[E峰、E/A值]、抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或 P＜0.05);心功能參數(shù) A峰、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(TNF-α)、炎性指標(biāo)(ESR、CRP)值顯著升高(P ＜0.01 或 P ＜0.05)。(3)與 AS穩(wěn)定期相比，AS活動(dòng)期心功能參數(shù)(E峰、EF、E/A值)、抗氧化指標(biāo)(SOD、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或P ＜0.05);通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)和炎性指標(biāo)(ESR、CRP)、AS臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值顯著升高(P ＜0.01 或 P ＜0.05)。(4)與 AS 患者 Keap1、Nrf2正常組比較，Keap1、Nrf2異常組心功能參數(shù)A峰顯著升高，E峰、E/A值顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。(5)相關(guān)性分析顯示，心功能參數(shù)E峰與抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈正相關(guān)，與通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指標(biāo)(ESR、CRP)、AS 臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)、免疫球蛋白 G(IgG)、病程呈負(fù)相關(guān);心功能參數(shù) A峰與通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)、AS臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)、心悸癥狀呈正相關(guān)，與通路蛋白 Keap1、抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈負(fù)相關(guān);心功能參數(shù) E/A比值與抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈正相關(guān)，與氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(TNF-α)、AS臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)、病程呈負(fù)相關(guān);心功能參數(shù)EF與病程呈負(fù)相關(guān);心功能參數(shù)FS與通路蛋白Keap1呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論:33.56%的AS患者存在心功能降低，表現(xiàn)為心功能參數(shù)E峰、E/A值顯著降低，A峰顯著升高;心功能參數(shù)E峰、E/A值均與抗氧化指標(biāo)、抑炎細(xì)胞因子呈正相關(guān)，與通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指標(biāo)、致炎細(xì)胞因子、炎癥指標(biāo)呈負(fù)相關(guān);而心功能參數(shù)A峰與通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指標(biāo)、致炎細(xì)胞因子呈正相關(guān)，與抗氧化指標(biāo)、抑炎細(xì)胞因子呈負(fù)相關(guān)。Keap1、Nrf2表達(dá)上升，Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路活化后，機(jī)體抗氧化能力下降，促使細(xì)胞因子失衡、炎癥指標(biāo)升高，導(dǎo)致免疫復(fù)合物異常沉積增多，在引起AS發(fā)病的同時(shí)出現(xiàn)心功能降低。

強(qiáng)直性脊柱炎;心功能;Keap1;Nrf2;氧化應(yīng)激

強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性、進(jìn)行性、自身免疫性疾病，其病變并非局限于關(guān)節(jié)，多引起關(guān)節(jié)以外的結(jié)締組織的病變。心血管系統(tǒng)因富含豐富的結(jié)締組織與血管，很容易受累。前瞻性研究表明AS相關(guān)的心血管疾病的發(fā)生率為10% ～30%[1]，顯著高于普通人心血管疾病的發(fā)生率[2]。一般認(rèn)為其發(fā)病與感染、遺傳和免疫有關(guān)，但確切發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。近年來(lái)，研究表明氧化應(yīng)激(Oxidative stress，OS)可能參與AS相關(guān)的心血管疾病病理過(guò)程，在其發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，核因子 NF-E2相關(guān)因子(Nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2)通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element，ARE)相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[3]。Keap1樣ECH相關(guān)蛋白 1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)-Nrf2/ARE作為機(jī)體內(nèi)有效的抗氧化調(diào)節(jié)通路，對(duì)于防御、減輕氧化應(yīng)激對(duì)人體的危害起著舉足輕重的作用[4]。

Nrf2廣泛存在于多種組織和細(xì)胞中，在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用。正常情況下，Keap1將Nrf2以二聚體形式錨定于胞漿，促使胞漿內(nèi)Nrf2持續(xù)泛素化并被蛋白酶不斷降解，從而抑制Nrf2激活[5]。應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧、活性氮和內(nèi)外源性電子激活劑可氧化Keap1上的巰基或磷酸化Nrf2分子中的絲氨酸和蘇氨酸殘基，從而改變Keap1或Nrf2空間構(gòu)象，抑制Keap1活性，導(dǎo)致Nrf2與Keap1分離，向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移;在核內(nèi)，Nrf2與小分子Maf蛋白結(jié)合形成二聚體，然后再與ARE結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化酶基因及II相解毒酶基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，抵抗氧化應(yīng)激和其他毒性損傷，實(shí)現(xiàn)其抗氧化和解毒作用[6-8]。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路的活化，是機(jī)體對(duì)環(huán)境毒物的一種應(yīng)激防御反應(yīng)能力的體現(xiàn)。

國(guó)外諸多醫(yī)家研究表明氧化水平升高和抗氧化能力下降可能與AS的發(fā)病有關(guān)，但AS關(guān)節(jié)外病變心功能的變化是否與氧化應(yīng)激紊亂有關(guān)?迄今為止未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9-20]。Keap1-Nrf2/ARE作為機(jī)體內(nèi)最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，在AS心功能損傷中扮演著何種角色?尚不清楚。故本次研究我們先假設(shè)Keap1-Nrf2/ARE通路活化是AS患者心功能降低的作用機(jī)制(簡(jiǎn)明機(jī)制示意圖請(qǐng)見圖1)，然后通過(guò)觀察AS患者心功能Keap1-Nrf2/ARE的變化，并將心功能變化與Keap1-Nrf2/ARE通路指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在說(shuō)明Keap1-Nrf2/ARE通路在AS患者心功能降低中的作用，探討心功能降低的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2012年5月-2013年6月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科住院病人中，隨機(jī)選取140例AS患者，其中男112例，女28例，男:女為4∶1，年齡18 ～60 歲，平均年齡(30.8 ±9.7)歲;病程0.5～28 年，平均病程(9.5 ±7.3)年。所有患者均符合依據(jù)1984年修訂的強(qiáng)直性脊柱炎紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)并參考2009年3月ASAS發(fā)布的中軸型SPA分類標(biāo)準(zhǔn)[21，22]，且排除原發(fā)性心血管疾病(如冠心病、先天性心臟病等)。另設(shè)60例正常對(duì)照(NC)組，男48 例，女12 例，男∶女為4∶1，年齡21～52 歲，平均年齡為(28.5±10.4)歲，均來(lái)自安徽中醫(yī)藥大

學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心，經(jīng)體檢和免疫學(xué)檢查排除自身免疫性疾病，均為身體健康、無(wú)明顯器質(zhì)性疾病者。兩組間年齡、性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究方案已通過(guò)我院倫理審查委員會(huì)審批，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)及方法

1.2.1 心功能測(cè)定 應(yīng)用美國(guó)GE VIVID 7超聲診斷儀，探頭頻率為2～5 mHz。具體操作:患者取左側(cè)臥位，對(duì)心臟進(jìn)行常規(guī)檢查，觀察瓣膜結(jié)構(gòu)、活動(dòng)度、異常血流和頻譜信號(hào)，測(cè)量二尖瓣口舒張?jiān)缙诜逯盗魉?E)、舒張晚期峰值流速(A)、舒張?jiān)缙诜逯盗魉?舒張晚期峰值流速(E/A)、左心房舒張期內(nèi)徑(LADd)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)，采用改良simpson法測(cè)量左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)、每搏輸出量(SV)、左心室短軸縮短率(FS)。所有指標(biāo)均連續(xù)測(cè)量3次，取平均值，超聲檢查的操作及分析均由高年資的專業(yè)超聲醫(yī)師完成。

1.2.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 留取患者血清10 ml，3 000 r/min離心15 min，分離后進(jìn)行4等份分裝，-80℃冷凍保存統(tǒng)一檢測(cè)。所有指標(biāo)均參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定值。采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA法)檢測(cè)AS患者和正常對(duì)照組血清中通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化應(yīng)激指標(biāo)[丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)、總抗氧化能力(TAOC)]、細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10)含量。Keap1、Nrf2 試劑盒購(gòu)自美國(guó) Millipore公司;MDA、ROS、RNS、SOD、CAT、TAOC試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 試劑盒購(gòu)自英國(guó)伯明翰公司。

圖1 AS心功能降低假說(shuō)Fig.1 Hypothesis of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis

1.2.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測(cè)定 所有被選對(duì)象均于清晨空腹時(shí)靜脈采血10 ml，采集后標(biāo)本立即送往安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)主要有:ESR、hs-CRP、IgG、IgA、IgM。檢測(cè)方法:ESR用魏氏法，以 mm/h表示;hs-CRP、IgG、IgA、IgM 用日立7060型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定，以mg/L表示。

1.2.4 主要癥狀量化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 參照衛(wèi)生部《新藥(中藥)臨床研究指導(dǎo)原則》[23]，將具體的心功能癥狀換算成積分值。

1.2.5 AS臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)評(píng)分[24]采用視覺模擬評(píng)分(Visual analog scales，VAS)、Bath強(qiáng)直脊柱炎疾病活動(dòng)指數(shù)(Bath ankylosing spondylitis disease active index，BASDAI)、Bath強(qiáng)直脊柱炎功能指數(shù)(Bath ankylosing spondylitis functional index，BASFI)、Bath強(qiáng)直脊柱炎計(jì)量指數(shù)(Bath ankylosing spondylitis metrology index，BASMI)、Bath 強(qiáng)直性脊柱炎總體指數(shù)(Bath ankylosing spondylitis global index，BAS-G)對(duì)AS患者進(jìn)行評(píng)分(0～10分)，分值越高，表示病情越重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，為連續(xù)性變量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x-±s表示，樣本均采用Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn);計(jì)量資料采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);而采用Spearman軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。當(dāng)P＜0.05或P＜0.01時(shí)，才認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS組與NC組心功能變化檢測(cè)結(jié)果 140例AS患者與60例NC組多普勒超聲異常率比較得知，AS組多普勒超聲心功能變化檢測(cè)結(jié)果異常率為33.56%，NC組異常率為8.33%。見表1。

表1AS組與NC組心功能異常率比較(n，%)Tab.1 Comparison of echocardiographic abnormality between AS group and NC group(n，%)

2.2 AS患者和NC組心功能參數(shù)、氧化應(yīng)激指標(biāo)、細(xì)胞因子、炎癥指標(biāo)的比較 與NC組相比，AS活動(dòng)期心功能參數(shù)(E峰、EF、E/A值)、抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或P＜0.05);心功能參數(shù)A峰、通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指標(biāo)(ESR、CRP)值顯著升高 (P＜0.01或P＜0.05)。與NC組相比，AS穩(wěn)定期心功能參數(shù)(E峰、E/A值)、抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或P＜0.05);心功能參數(shù)A峰、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(TNF-α)、炎性指標(biāo)(ESR、CRP)值顯著升高(P＜0.01或 P＜0.05)。與AS穩(wěn)定期相比，AS活動(dòng)期心功能參數(shù)(E 峰、EF、E/A 值)、抗氧化指標(biāo)(SOD、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或 P＜0.05);通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)和炎性指標(biāo)(ESR、CRP)、AS 臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值顯著升高(P＜0.01或 P＜0.05)。見表2。

表2 AS患者和NC組心功能參數(shù)、氧化應(yīng)激指標(biāo)等指標(biāo)的比較( ± s)Tab.2 Comparison of indicators such as oxidative stress andcardiacfunction parametersbetween AS group and NC group(±s)

表2 AS患者和NC組心功能參數(shù)、氧化應(yīng)激指標(biāo)等指標(biāo)的比較( ± s)Tab.2 Comparison of indicators such as oxidative stress andcardiacfunction parametersbetween AS group and NC group(±s)

Note:Vs NC group，1)P ＜0.01，2)P ＜0.05;vs NC group，3)P ＜0.01，4)P ＜0.05;vs AS in stable stage group，5)P ＜0.01，6)P ＜ 0.05.LADd:Left artrial diastolic diameter;LVDd:Left ventricular diastolic diameter;LVPWTd: Left ventricular posterior wall thickness at end-diastole;FS:Fraction shortening;EF:Ejection fraction;SV:Stroke volume;E peak:early diastolic E;A peak:late diastolic A.

Index NC group(60) AS in active stage(98) AS in stable stage(42) LADd(mm) 5.26 ±1.05 25.67 ±2.15 28.26 ±3.51 27.18 ±2.94 LVDd(mm) 46.17 ±1.34 44.69 ±1.84 45.23 ±1.46 LVPWTd(mm) 8.67 ±0.65 8.47 ±0.64 8.53 ±0.78 E peak(m/s) 1.25 ±0.32 0.92 ±0.121)5) 1.13 ±0.173) A peak(m/s) 0.83 ±0.18 1.09 ±0.281) 1.01 ±0.213) E peak/A peak 1.66 ±0.33 1.18 ±0.241)5) 1.31 ±0.363) SV(ml) 68.10 ±9.01 67.11 ±8.96 67.57 ±9.12 EF 66.01 ±5.87 63.34 ±3.221)5) 65.42 ±3.91 Keap1(ng/ml) 4.82 ±3.26 7.30 ±5.311)5) 4.98 ±3.34 Nrf2(ng/ml) 6.01 ±4.02 8.39 ±3.432)6) 6.78 ±4.69 ROS(ng/ml) 2.77 ±0.09 3.81 ±0.441)6) 3.26 ±0.254) RNS(U/ml) 97.82 ±6.83 133.12 ±24.231)5) 106.52 ±10.684) MDA(nmol/ml)10.65 ±6.11 34.36 ±19.711)5) 21.23 ±11.422) SOD(U/ml) 163.73 ±46.52 130.23 ±36.292)6) 142.68 ±39.864) CAT(ku/L) 301.48 ±130.46 226.57 ±122.931)251.33 ±126.524)6) TAOC(U/ml) 3.13 ±0.54 2.11 ±0.171)6) 2.69 ±0.464) IL-1β(pg/ml) 2.58 ±1.72 3.76 ±2.831)5) 2.87 ±2.25 TNF-α(ng/L) 19.76 ±17.8 280.25 ±167.681)5) 89.93 ±25.243) IL-4(ng/L) 425.61 ±246.18 355.65 ±262.132) 387.73 ±233.644) IL-10(ng/L)171.52 ±32.24 101.67 ±14.561)6) 138.45 ±27.464) ESR(mm/h) 9.21 ±3.53 32.27 ±12.511)5) 11.37 ±3.69 CRP(mg/L) 1.96 ±0.85 22.65 ±2.731)5) 5.48 ±0.74 VAS 0 8.34 ±2.585) 5.12 ±1.26 BASDAI 0 7.45 ±1.965) 5.31 ±1.68 BASFI 0 6.84 ±1.885) 4.97 ±1.62 BASMI 0 8.59 ±1.765) 5.48 ±1.59 BAS-G 0 8.12 ±1.165)

2.3 AS患者外周血Keap1、Nrf2異常者心功能變化 以60例正常對(duì)照組外周血Keap1、Nrf2數(shù)值統(tǒng)計(jì)正常值區(qū)間，Keap1(1.99 ～12.61 ng/ml)、Nrf2 (2.01 ～10.03 ng/ml)，篩選出 AS 患者 Keap1、Nrf2異常組別。與Keap1正常組比較，Keap1異常組心功能參數(shù) LADd、A峰升高，E峰、E/A值降低;與Nrf2正常組比較，Nrf2異常組心功能參數(shù)A峰升高，E 峰、E/A 值、EF降低(P ＜0.05或 P ＜0.01)。與Nrf2異常組比較，Keap1異常組心功能參數(shù)A峰升高，E峰、E/A值降低(P ＜0.05或 P ＜0.01)。見表3。

2.4 AS患者外周血 Keap1和 Nrf2表達(dá)與氧化應(yīng)激指標(biāo)、細(xì)胞因子、心功能癥狀等指標(biāo)的相關(guān)分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，AS患者外周血通路蛋白Keap1表達(dá)與氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子 (IL-1β、TNF-α)、疾病活動(dòng)性指標(biāo) (ESR、CRP)、AS 臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值、心悸癥狀呈正相關(guān)(P ＜0.05 或P ＜0.01);與抗氧化指標(biāo)(SOD、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈負(fù)相關(guān)(P ＜0.05或 P ＜0.01)。AS患者外周血Nrf2表達(dá)與抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05或 P＜0.01);與氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、AS 臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)(VAS、BASDAI、BASFI)值、心悸癥狀呈正相關(guān)(P ＜0.05或P ＜0.01)。見表4。

表3 AS患者外周血Keap1、Nrf2異常者心功能參數(shù)變化(±s)Tab.3 Change of cardiac function parameters in AS patients with abnormal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood(±s)

表3 AS患者外周血Keap1、Nrf2異常者心功能參數(shù)變化(±s)Tab.3 Change of cardiac function parameters in AS patients with abnormal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood(±s)

Note:Vs NC group of the same group，1)P ＜0.01，2)P ＜0.05;vs abnormal Nrf2 group，3)P ＜0.01，4)P ＜0.05.

Cardiac function parameters Keap1 Nrf2 Abnormal (n=56) Normal (n=84) Abnormal (n=51) Normal (n=89) LADd(mm) 28.78 ±3.812) 66.13 ±5.73 25.43 ±2.21 26.02 ±1.83 25.69 ±2.11 LVDd(mm) 45.5 ±12.07 45.96 ±1.5845.91 ±1.5846.15 ±1.38 LVPWTd(mm) 8.56 ±0.65 8.53 ±0.76 8.58 ±0.76 8.62 ±0.66 E peak(m/s)1.03 ± 0.311)3)1.21 ± 0.38 0.98 ±0.231)1.23 ± 0.35 A peak(m/s)0.98 ±0.172)3)0.86 ±0.13 1.07 ±0.261)0.83 ±0.18 E peak/A peak 1.41 ±0.411)4)1.63 ±0.37 1.39 ±0.361)1.65 ±0.32 SV(ml) 68.15 ±9.78 68.23 ±8.9568.13 ±8.9168.19 ±8.87 EF(%) 65.85 ±5.89 66.01 ±5.87 64.08 ±5.152)

表4 AS患者外周血Keap1和Nrf2表達(dá)與氧化應(yīng)激指標(biāo)、細(xì)胞因子、心功能癥狀等指標(biāo)的相關(guān)分析(r，n=140)Tab.4 Correlation analysis of the Keap1 and Nrf2 expression with related indicatorssuch asoxidative stress，cytokines，symptoms of cardiac function in AS patients(r，n=140)

表5 AS患者心功能參數(shù)與氧化應(yīng)激、心功能癥狀等指標(biāo)的相關(guān)分析(r，n=140)Tab.5 Correlation analysis of cardiac function parameters with related indicators such as oxidative stress，cytokines，symptoms of cardiac function in AS patients(r，n=140)

2.5 AS患者心功能參數(shù)與氧化應(yīng)激指標(biāo)、癥狀體征積分等指標(biāo)的相關(guān)分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，心功能參數(shù)E峰與抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈正相關(guān)，與通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)、AS 臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)(VAS、BAS-DAI、BASFI、BASMI、BAS-G)、炎 性 指 標(biāo) (ESR、CRP)、免疫球蛋白G(IgG)、病程呈負(fù)相關(guān);心功能參數(shù)A峰與通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)、AS 臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)、心悸癥狀呈正相關(guān)，與抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈負(fù)相關(guān);心功能參數(shù) E/A比值與抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈正相關(guān)，與通路蛋白 Keap1、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(TNF-α)、AS臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)、病程呈負(fù)相關(guān);心功能參數(shù)EF與心悸癥狀、病程呈負(fù)相關(guān);心功能參數(shù)FS與通路蛋白Keap1呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。見表5。

3 討論

強(qiáng)直性脊柱炎是以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱中軸關(guān)節(jié)慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，臨床上若延誤診治，易引起關(guān)節(jié)以外的結(jié)締組織的病變[25]。心血管系統(tǒng)因富含豐富的結(jié)締組織與血管，因此很容易受累。自由基是機(jī)體內(nèi)很強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力的分子、離子、原子或原子團(tuán)，當(dāng)自由基過(guò)度產(chǎn)生或機(jī)體的抗氧化防御體系功能受損時(shí)，機(jī)體將處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[26，27]。

本研究結(jié)果顯示，33.56%的AS患者存在心功能降低，與NC組相比，AS患者心功能參數(shù)(E峰、E/A、EF)值均顯著降低(P＜0.01);A峰顯著升高(P＜0.01)。與NC組相比，AS患者血清中SOD、CAT、TAOC值均顯著降低(P ＜0.01或 P ＜0.05)，ROS、RNS、MDA 值顯著升高(P ＜0.01或 P ＜0.05)。ROS、RNS、MDA 是反映機(jī)體氧化水平的關(guān)鍵指標(biāo);而SOD、CAT、TAOC是反映機(jī)體抗氧化水平的關(guān)鍵指標(biāo);本研究發(fā)現(xiàn)心功能降低的AS患者存在氧化應(yīng)激紊亂，處于氧化水平升高和抗氧化能力明顯下降的狀態(tài)。與NC組相比，AS患者細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)和炎性指標(biāo)(ESR、CRP)值顯著升高(P ＜0.01)，細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)值顯著降低(P＜0.01或 P ＜0.05)。與 AS穩(wěn)定期相比，AS活動(dòng)期臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值顯著升高(P ＜0.01或 P ＜0.05)。IL-1β、TNF-α 屬于致炎細(xì)胞因子[28]，而 IL-4、IL-10 屬于抗炎細(xì)胞因子，ESR、CRP、VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G可反映疾病的活動(dòng)程度和嚴(yán)重程度;本研究發(fā)現(xiàn)心功能降低的AS患者處于疾病活動(dòng)狀態(tài)且存在細(xì)胞因子失衡，炎性細(xì)胞因子含量明顯升高，與NC組相比，心功能降低的AS患者 Keap1、Nrf2表達(dá)上升;這表明心功能降低的AS患者存在Keap1-Nrf2/ARE通路的活化。

圖2 AS心功能降低機(jī)制Fig.2 Mechanism of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis

為進(jìn)一步驗(yàn)證Keap1-Nrf2/ARE通路在AS患者心功能降低中的影響，本研究發(fā)現(xiàn)，與AS患者外周血Keap1、Nrf2正常組比較，Keap1、Nrf2異常組心功能參數(shù)E峰、E/A、EF值均顯著降低;A峰顯著升高，提示AS患者外周血Keap1、Nrf2升高會(huì)直接或間接導(dǎo)致心功能降低。

本研究通過(guò)相關(guān)分析得知，心功能降低的AS患者心功能參數(shù)E峰與抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、抑炎細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈正相關(guān)，而與通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指標(biāo)(ESR、CRP)、免疫球蛋白G(IgG)、病程呈負(fù)相關(guān);心功能參數(shù)A峰與通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)、心悸呈正相關(guān)，與抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)、抑炎細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈負(fù)相關(guān)。而AS患者外周血通路蛋白 Keap1表達(dá)與氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)、疾病活動(dòng)性指標(biāo)(ESR、CRP)、AS 臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)、心悸癥狀呈正相關(guān);與抗氧化指標(biāo)(SOD、TAOC)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈負(fù)相關(guān)。AS患者外周血 Nrf2表達(dá)與抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)呈負(fù)相關(guān);與氧化指標(biāo)(ROS、RNS、MDA)、AS 臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)(VAS、BASDAI、BASFI)、心悸癥狀呈正相關(guān)。這提示Keap1、Nrf2的水平與AS疾病活動(dòng)狀態(tài)、氧化應(yīng)激狀態(tài)、細(xì)胞因子平衡、心功能參數(shù)明顯相關(guān)。當(dāng)體內(nèi)(ROS、RNS)等氧化指標(biāo)含量升高時(shí)，Keap1、Nrf2表達(dá)上升，Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路活化，抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、TAOC)含量下降，機(jī)體抗氧化能力降低，促使細(xì)胞因子失衡(IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子含量升高，而IL-4、IL-10等抑炎細(xì)胞因子含量降低)ESR、CRP等疾病活動(dòng)性指標(biāo)升高，導(dǎo)致免疫復(fù)合物異常沉積增多，促使AS發(fā)病，當(dāng)免疫復(fù)合物異常沉積于心組織時(shí)，致使心組織或器官受到損傷或破壞，UCG檢測(cè)則提示反映心室舒張功能的指標(biāo)E峰和E/A比值下降，A峰升高;反映心室收縮功能的指標(biāo)射血分?jǐn)?shù)EF降低，臨床上則出現(xiàn)心悸等心功能降低癥狀。

本研究結(jié)果與本研究前假說(shuō)基本一致(見圖2)，鑒于以上研究結(jié)果，我們可以認(rèn)為氧化應(yīng)激可能參與了AS心功能降低的發(fā)生與發(fā)展，Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路的活化可能是心功能降低的機(jī)制。

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[收稿2013-09-25 修回2013-11-20]

(編輯 許四平)

Exploring mechanism of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis based on Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway

QI Ya-Jun，LIU Jian，ZHENG Li，WAN Lei，CAO Yun-Xiang，SUN Yue，WANG Fang.Graduate Department of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China

Objective:To explore the mechanism of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis based on Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway.MethodsExperiment group included 140 ankylosing spondylitis(AS)patients and control group included 60 healthy individuals.Echocardiography(UCG)was used to detect cardiac function parameters.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was adopted to determine serum proteins，oxidative stress indicators and cytokines.Erythrocyte sedimentation and plasma C reactive protein，immunoglobulin were detected with Westergren method and Hitachi 7060 automatic biochemical analyzer respectively.Results(1)Compared with the normal control group，character of AS group in active stage:cardiac function parameters(E peak，EF，E/A)，antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)decreased(P ＜ 0.01 or P ＜ 0.05 all).A peak，Keap1，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1，TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)increased(P ＜ 0.01 or P ＜0.05 all).(2)Compared with the normal control group，character of AS group in stable stage:cardiac function parameters(E peak，E/A)，Keap1，antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)decreased(P ＜0.01 or P ＜0.05 all).A peak，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)increased(P ＜ 0.01 or P ＜0.05 all).(3)Compared with AS group in stable stage，character of AS group in active stage:cardiac function parameters(E peak，EF，E/ A)，antioxidant indicators(SOD，TAOC)，cytokines(IL-10)decreased(P ＜0.01 or P ＜0.05 all).Keap1，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1β，TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)，clinical evaluation indicators(VAS，BASDAI，BASFI，BASMI，BAS-G)increased(P ＜0.01 or P ＜0.05 all).(4)Compared with AS patients with normal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood，A peak increased while E peak and E/A decreased in AS patients with abnormal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood(P ＜0.01 or P ＜0.05).(5)Spearman correlation analysis showed:AS parameters of cardiac function in patients with E peak and antioxidant indicators (SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)showed significant positive correlation.E peak and Keap1，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1β，TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)，clinical evaluation indicators(VAS，BASDAI，BASFI，BASMI，BAS-G)，IgG，course of the disease were significantly negatively correlated.A peak and Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1β，TNF-α)，clinical evaluation indicators，Palpitation showed significant positive correlation.A peak and antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)were significantly negatively correlated.E/A and Keap1，antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)showed significant positive correlation.E/A and oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(TNF-α)，cxcinical evaluation indicators，course of the disease were significantly negatively correlated.EF and course of the disease were significantly negatively correlated.FS and Keap1 showed significant negative correlation.ConclusionCardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis is 33.56%.The characteristic performance is that E peak，E/A decreased while A peak increased.E peak，E/A and antioxidant indicators，anti-inflammatory cytokines show significant positive correlation.E peak，E/ A and Keap1，oxidation index，pro-inflammatory cytokines，inflammatory indicators are significantly negatively correlated.A peak and Keap1，oxidation index，pro-inflammatory cytokines show significant positive correlation.A peak and antioxidant indicators，anti-inflammatory cytokines are significantly negatively correlated.The rising of Keap1 expression cause activate the Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway.After the signaling pathway is activated，the body′s antioxidant ability decreased，pro-inflammatory cytokines imbalanced，inflammation index increased.When the body is long be in unbalance condition，the number of abnormal immune complex deposition increased.In the end，the result is that AS is caused and cardiac function is decreased.

Ankylosing Spondylitis;Cardiac function;Keap1;Nrf2;Oxidative stress

R593.23

A

1000-484X(2014)05-0654-08

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.019

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81173211)、國(guó)家中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)痹病學(xué)建設(shè)項(xiàng)目(國(guó)中醫(yī)藥發(fā)[2009]30號(hào))、安徽省科技廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(09020304046)、安徽省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(2009ZY05)、安徽現(xiàn)代中醫(yī)內(nèi)科應(yīng)用基礎(chǔ)與開發(fā)研究省級(jí)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(科條[2008]150號(hào))、安徽中醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2010TD005)資助。

②安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，合肥230031。

③Department of Radiation Biology，City of Hope National Medical Center and Beckman Research Institute，Duarte，CA91010，USA。

齊亞軍(1987年-)，男，主要從事中醫(yī)藥防治風(fēng)濕病的研究。

及指導(dǎo)教師:劉 健(1964年-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治風(fēng)濕病的研究，E-mail:liujianahzy@126.com。