馬嵋，姜濤，張春，魏琴，段明軍，王雪梅，李志強(qiáng)，壽璽，陳啟龍

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院新疆醫(yī)學(xué)動物模型研究重點實驗室，烏魯木齊 830054)

海拔在3000 m 以上的地區(qū)，稱為高原地區(qū)，其特點為氣壓低，氧分壓也相應(yīng)降低，易導(dǎo)致人體缺氧。高原低氧條件下，過度通氣、紅細(xì)胞生成、酸堿平衡、血液學(xué)改變和血管生成等介導(dǎo)了高原低氧習(xí)服過程［1］。反之，如果人體對外界低氧環(huán)境應(yīng)激失敗，就會發(fā)生高原病。高原環(huán)境改變著整個生命規(guī)律，不同的動物種屬有不同的生物學(xué)適應(yīng)模式。高原環(huán)境改變著某些疾病發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，高血壓、冠心病、心肌梗塞的相對發(fā)病率在高原地區(qū)低于平原，而與肺動脈高壓相關(guān)的某些先心病和慢性阻塞性肺疾患則發(fā)病率很高。這些特點揭示了環(huán)境與疾病間的密切關(guān)系。新疆灰旱獺是肝炎、肝癌、肥胖病、心血管疾病、腎炎等疾病的良好動物模型，因其在天山2000 ～3800 m 的高山草原上繁衍生息，又是研究高原低氧適應(yīng)機(jī)理的理想實驗動物。本文觀察了新疆灰旱獺的右心室組織學(xué)結(jié)構(gòu)，為全面和深入研究新疆灰旱獺低氧適應(yīng)機(jī)理提供動物實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

新疆灰旱獺組:新疆灰旱獺6 只，捕自新疆呼圖壁縣境內(nèi)(海拔2000 ～3800 m)，海拔大于3000 m，依據(jù)尾部及皮膚毛色判斷年齡均大于兩周歲，體重4 ～5 kg，雌性2 只，雄性4 只?；液但H捕捉后在實驗室飼養(yǎng)7 d 適應(yīng)新的飼養(yǎng)環(huán)境后再進(jìn)行實驗。SD大鼠組:SD 大鼠6 只，雌雄各半，體重250 ～270 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供［SCXK(新)2011-0004］。大鼠分籠飼養(yǎng)，正常光照，自由飲水和攝食，溫度22℃，相對濕度50% ～70%。動物實驗按照實驗動物飼養(yǎng)和使用指南規(guī)定進(jìn)行，并通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心動物飼養(yǎng)和管理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號:A-20120309008。

1.1.2 試劑

一抗為兔抗大鼠CX43 多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);SP 免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和病理形態(tài)學(xué)觀察

給予各組實驗動物靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液大于標(biāo)準(zhǔn)麻醉劑量的3 倍，然后采用無菌技術(shù)開胸，取出心臟。用冷鹽水沖洗后取右心室標(biāo)本。用4%甲醛固定，經(jīng)過石蠟包埋切片，室溫下放置備用。各組實驗動物取相同部位的右心室組織包埋，切片，每只動物切片15 張，每組切片90 張。每只動物的蠟塊取5 張切片常規(guī)HE 染色，顯微鏡下(放大倍數(shù)400 ×)，每張切片攝取相同部位的5 個視野觀察組織像。每只動物的蠟塊取5 張切片經(jīng)Masson 染色，顯微鏡下拍片(放大倍數(shù)400 ×)，每張切片攝取相同部位的5 個視野。用ImagePro-Plus 圖像分析軟件計算心肌膠原容積百分比(CVF)。

1.2.2 縫隙連接蛋白43(connexin 43，CX43)蛋白的免疫組化檢測

每只實驗動物取5 張石蠟切片，片厚4 μm。標(biāo)本脫蠟、高壓熱修復(fù)抗原。采用SP 免疫組化染色法對CX43 染色。陰性對照以PBS 代替一抗，CX43著色表現(xiàn)為胞質(zhì)染成棕褐色為陽性結(jié)果。陽性細(xì)胞必須具備:細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，陽性顆粒定位和定性好;著色明顯高于背景［2］。切片選取5 個不重復(fù)高倍(×400)視野。

1.2.3 右心室肥厚指數(shù)(RVHI)、體重指數(shù)(CPI)和心室纖維化程度(CVF)比較

分離出右心室、左心室和室間隔，用濾紙吸干水分后稱其質(zhì)量，計算右心室重/(左心室重 + 室間隔重)［RV/(LV + S)］和右心室重量/體重量(RW/BW)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量檢測結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間率的比較采用Fisher 精確概率檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組右心室組織HE 染色、Masson 染色和CX43 表達(dá)

新疆灰旱獺右心室組織的HE 染色心肌細(xì)胞排列紊亂，呈波紋狀;細(xì)胞核大小不規(guī)則，心肌細(xì)胞之間的間隔增寬。如圖1-A。Masson 染色膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)色，肌肉和胞質(zhì)紅細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，大量膠原纖維相互連接成網(wǎng)狀。如圖1-B。CX43 蛋白表達(dá)著色較淡，在心肌潤盤處呈斑點分布。如圖1-C。SD 大鼠HE 染色結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，細(xì)胞核大而清晰。如圖2-A。肌纖維為紅色，Masson 染色結(jié)果顯示，膠原纖維為藍(lán)綠色，少量分布于肌纖維之間，膠原組織分布均勻。如圖2-B。CX43 蛋白表達(dá)清楚，位于心肌潤盤處。如圖2-C。

2.2 兩組右心室肥厚指數(shù)、體重指數(shù)及纖維化程度比較

結(jié)果顯示，與SD 大鼠組比較，新疆灰旱獺組的右心室肥厚指數(shù)、體重指數(shù)及纖維化程度明顯增高(P ＜0.05)。

3 討論

高原低氧環(huán)境對心血管系統(tǒng)的影響，主要是心肌的缺氧或低氧血癥所致，故除高原反應(yīng)外，各類型高原病中都可能或多或少有不同程度的心肌損害。心血管系統(tǒng)是高原低氧環(huán)境下受影響較大的系統(tǒng)之一［3］，急性與慢性高原低氧對機(jī)體的影響及機(jī)體對低氧環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制深受人們關(guān)注。高原心臟適應(yīng)性變化以右心室為主的心肌細(xì)胞肥大、纖維化伴心功能上調(diào)為主要特點。Naeije 等［4］實驗表明，缺氧對離體心肌纖維具有負(fù)性肌力作用。心肌細(xì)胞對缺氧非常敏感，能量代謝障礙是缺氧后心肌損害的重要機(jī)制，缺氧后心肌細(xì)胞能量產(chǎn)生障礙、氧自由基堆積、細(xì)胞膜滲透性改變，興奮收縮偶聯(lián)機(jī)制破壞，影響心肌的收縮功能［5］。國內(nèi)動物實驗證實［6］，缺氧對心肌的損害，可導(dǎo)致左心功能的輕度減退，表現(xiàn)為心肌收縮力及原功能的降低。Heath 等［7］實驗研究證實，將大鼠暴露于模擬海拔5500 m 高原，5 周后即出現(xiàn)了右心室增大。為適應(yīng)高原缺氧環(huán)境機(jī)體會產(chǎn)生復(fù)雜的代償適應(yīng)性變化，具體表現(xiàn)在心臟方面則發(fā)生以右心室為主的心功能顯著改變，以適應(yīng)低氧環(huán)境，滿足組織對氧的需求。以右心室肌肥厚、心肌纖維化為主的心肌重塑是缺氧環(huán)境下心功能代償?shù)慕M織學(xué)基礎(chǔ)?？p隙連接的構(gòu)成及連接蛋白的表達(dá)、分布的改變可能是不同心臟病中心律失常發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。Rudy 等［8］實驗顯示，間隙連接蛋白數(shù)量的減少使心肌的電傳導(dǎo)速度減慢，心肌各部位的興奮性不均一，可能導(dǎo)致單項阻滯。而心肌細(xì)胞肥大、膠原纖維增生可能是導(dǎo)致CX43 水平下降的原因。本實驗研究顯示新疆灰旱獺右心室CX43 蛋白表達(dá)較弱，HE 染色和Masson 染色顯示心肌細(xì)胞肥大，膠原纖維比SD 大鼠明顯增多，心室肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)，CX43 是構(gòu)成心室間隙連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白，連接蛋白表達(dá)減少和(或)分布的改變，進(jìn)一步導(dǎo)致縫隙連接通道的重構(gòu)，興奮收縮及電偶聯(lián)機(jī)制破壞。

表1 右心室肥厚指數(shù)、體重指數(shù)及纖維化程度比較(±s，%，n=6)Tab.1 Comparison right ventricle hypertrophy index，the cardiac ponderal index and cardiac ventricular fibrosis of Xinjiang Marmota baibacina group and SD rats group

表1 右心室肥厚指數(shù)、體重指數(shù)及纖維化程度比較(±s，%，n=6)Tab.1 Comparison right ventricle hypertrophy index，the cardiac ponderal index and cardiac ventricular fibrosis of Xinjiang Marmota baibacina group and SD rats group

注:與新疆灰旱獺組相比，* P ＜0.05.Note:Compared with the Xinjiang Marmota baibacina group，* P ＜0.05

分組Group RVHI CPI CVF新疆灰旱獺組Xinjiang Marmota baibacina group 41.25 ±3.25 0.84 ±0.02 13.14 ±2.54 SD 大鼠組SD rat group 30.36 ±2.14* 0.78 ±0.05* 7.56 ±2.35*

國外資料表明，高原低氧對心臟重構(gòu)的作用主要是指右心室重構(gòu)包括:心肌實質(zhì)的改變:心室壁增厚或心腔擴(kuò)大，質(zhì)量和體積增加［9，10］。心肌間質(zhì)的重構(gòu):心臟間質(zhì)膠原纖維增多，網(wǎng)絡(luò)紊亂。本研究結(jié)果顯示，新疆灰旱獺右心室肥厚指數(shù)、體重指數(shù)及纖維化程度均高于SD 大鼠，進(jìn)一步提示新疆灰旱獺右心室肥厚，心肌纖維化明顯，表明新疆灰旱獺在高原低氧適應(yīng)過程中右心室結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)。新疆灰旱獺系嚙齒目松鼠科旱獺屬的大型地棲性嚙齒動物，近年來用該動物制作人類疾病的動物模型的研究越來越深入，本實驗選擇新疆高原地區(qū)灰旱獺為研究對象是高原低氧適應(yīng)性機(jī)制的理想實驗動物。實驗結(jié)果對新疆高原病動物模型的選擇和深入研究缺氧性心肌重塑的發(fā)生機(jī)制，闡明高原心臟病的發(fā)生機(jī)制和尋找有效的防治措施具有十分重要的意義。

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