韓華中，楊俊

(上海交通大學(xué)附屬上海第六人民醫(yī)院普外科，上海 200233)

近年來倍受臨床重視的條件致病菌－銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，俗稱綠膿桿菌，為革蘭陰性桿菌，在正常人皮膚、呼吸道、腸道及環(huán)境廣泛存在［1］，與燒傷感染、敗血癥、下呼吸道感染、腸道感染、外科創(chuàng)傷及術(shù)后感染等的關(guān)系極為密切［2，3］，在革蘭陰性菌引起的院內(nèi)感染中，銅綠假單胞菌所占比例一直處于前列［4－6］。由于銅綠假單胞菌固有的特性，表現(xiàn)出對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氯霉素類、喹諾酮類、四環(huán)素類和磺胺類等多種抗菌藥物存在天然或獲得性多重耐藥(multidrug resistance)，使得治療銅綠假單胞菌感染十分困難，目前尚缺乏控制其感染的確切手段，人們試圖通過多種方法來解決這一問題。本研究通過不同處理方法建立腸道多重耐藥銅綠假單胞菌感染動物模型，為研究和治療因耐藥菌引起的感染提供良好的實驗?zāi)Ｐ偷於ɑA(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株

多重耐藥銅綠假單胞菌(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa，MDR-PA )為上海市第六人民醫(yī)院臨床微生物檢驗中心分離的臨床菌株，標(biāo)準(zhǔn)為對青霉素類、頭孢菌素類、碳?xì)涿赶导唉?內(nèi)酰胺酶抑制劑等均耐藥，經(jīng)過藥敏實驗和全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定。MDR-PA 菌株于5%羊瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)35℃普通恒溫箱培養(yǎng)12 h，菌體懸于無菌Ringer 緩沖液中，利用分光光度法配制成1.0 × 109CFU /mL 濃度的MDR-PA 懸液。

1.2 試劑和儀器

培養(yǎng)皿;M-H 瓊脂平板，5%羊血瓊脂培養(yǎng)基;心腦浸出液培養(yǎng)基，藥敏卡:美羅培南(MEM 10 μg)、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF 105 pg )、頭孢吡肟(FEP 30 μg )、哌拉西林/他唑巴坦(TZP110 )、環(huán)丙沙星(CIP 5 μg )均購自英國Oxoid 公司;腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor alpha，TNF-α )和干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ )檢測試劑盒，BD Pharmingen，Oxford，UK;高效冷凍離心機(jī);紫外分光光度計;Microscan Autoscan-4 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和RAID 板;Ultra-Turrax 勻漿儀;DNP-9028 恒溫培養(yǎng)箱;Espec BNA-311 二氧化碳培養(yǎng)箱等。

1.3 實驗動物、分組及處理

6 周齡SPF 級雄性BALB / c 小鼠24 只，平均體重(17.53 ±1.35 )g，購于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗室，由上海西普爾-必凱實驗動物公司提供【SCXK(滬)2008-0016】。實驗在上海市第六人民醫(yī)院進(jìn)行【SYXK(滬)2011-0128】。分成①正常對照組;②多重耐藥銅綠假單胞菌(MDR-PA )組;③MDR-PA + 抗生素組;④MDR-PA + 禁食組，6 只/組。正常對照組每日給予0.5 mL 生理鹽水灌胃，連續(xù)7日;MDR-PA 組每日給予1.0 × 109CFU/mL，0.5 mL 的PA 懸液灌胃，連續(xù)7日;MDR-PA + 抗生素組:以頭孢曲松鈉終濃度每日8g /(bw·kg )的劑量［7］，自由飲水(14.4 mg/mL )，每天更換一次飲水，連續(xù)3d 后，每日給予1.0 ×109CFU/mL，0.5 mL 的PA 懸液灌胃7d;MDR-PA + 禁食組小鼠禁食1d 后，每日給予1.0 × 109CFU/mL，0.5 mL 的PA 懸液灌胃，連續(xù)7日。實驗過程中每天同一時間段對各組小鼠精神狀態(tài)、糞便情況觀察并記錄;用電子稱稱小鼠體重。于第11 天結(jié)束實驗，頸椎脫臼法處死小鼠，取回盲部內(nèi)容物經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 +藥敏實驗，留取結(jié)腸組織標(biāo)本備用。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定、藥敏實驗

實驗結(jié)束后，無菌收集回盲部內(nèi)容物，稱重(約0.1 ～0.2 g )，置于2.5 mL Ringer 緩沖液，勻漿系列10 倍稀釋(10－1、10－2，10－3、10－4、10－5)。取100 μL稀釋液種植于5%羊血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，分離銅綠假單胞菌，經(jīng)Microscan Autoscan-4 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定后，對鑒定出的銅綠假單胞菌接種M-H 瓊脂平板上法國梅里埃VITEK2 AST-GN09 藥敏卡進(jìn)行K-B 紙片擴(kuò)散法藥物敏感實驗。

1.5 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察和炎癥評分

將新鮮收集的小鼠結(jié)腸組織標(biāo)本迅速置于4%甲醛中，經(jīng)常規(guī)處理后6 μm 切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察，并依據(jù)修改后的Berg 等［7］評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

1.6 促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IFN-γ的ELISA 檢測

預(yù)先配置含有PBS、2% (v/v )小牛血清和0.5% (w/v )十六烷基三甲基溴的勻漿緩沖液，將小鼠結(jié)腸組織解凍、切割、稱重后置于800 μL 上述緩沖液中進(jìn)行勻漿，組織勻漿后4 ℃離心15 min (3000 r/min )，收集上清液置于－80℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。按照ELISA 試劑盒檢測結(jié)腸組織中TNF-α 及IFN-γ 水平。每個結(jié)腸提取物中的蛋白含量通過BCA 法進(jìn)行定量。TNF-α 及IFN-γ 水平表達(dá)為pg/mg 結(jié)腸組織。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以mean ±sD 表示，兩組間比較采用Student’s t 檢驗。P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。P ＜0.01 表示差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠精神狀態(tài)、糞便和體重變化

正常對照組，小鼠糞便正常，精神狀態(tài)好，體重逐漸上升;MDR-PA 組、MDR-PA + 抗生素組和MDR-PA+禁食組小鼠糞便呈膿稀便或膿便，精神萎靡，體重逐漸減輕，較對照組體重差異有顯著性(P ＜0.01 );MDR-PA + 抗生素組小鼠糞便呈膿便，精神萎靡，體重明顯減輕較MDR-PA 組和MDRPA + 禁食組差異有顯著性(P ＜0.05)(圖1)。

圖1 各組小鼠每天體重變化情況Fig.1 Changes of body weight of the mice

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定、藥敏實驗結(jié)果

正常對照組細(xì)菌培養(yǎng)未見銅綠假單胞菌生長，其余三組細(xì)菌培養(yǎng)均見銅綠假單胞菌生長，鑒定及藥敏實驗結(jié)果均同灌胃細(xì)菌無差別(圖2，彩插7)。

2.3 結(jié)腸組織HE 染色鏡下觀察結(jié)果

正常對照組:基本無炎癥病變表現(xiàn);MDR-PA 組和MDR-PA + 禁食組病變累及黏膜大部，炎癥中度，黏膜下層充滿單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞;MDR-PA+ 抗生素組重度炎癥，炎癥細(xì)胞為單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的混合組成，有時可透壁，上皮增生明顯，可見上皮細(xì)胞擁擠在長腺體內(nèi)。含黏液的細(xì)胞幾乎不可見，隱窩膿腫和潰瘍可見，此組病變程度較MDRPA 組和MDR-PA + 禁食組嚴(yán)重(圖3，彩插7)。

2.4 結(jié)腸炎癥評分結(jié)果

三個實驗組較正常對照組炎癥評分明顯升高，差異有顯著性(P ＜0.01 );MDR-PA + 抗生素組炎癥評分較MDR-PA + 禁食組、MDR-PA 組差異有顯著性(P ＜0.05 );MDR-PA + 禁食組與MDRPA 組的炎癥評分無明顯差別(圖4 )。

圖4 各組的炎癥評分結(jié)果Fig.4 Inflammation scores of the mouse groups

2.5 炎癥因子TNF-α 和INF-γ 濃度檢測結(jié)果

各實驗組結(jié)腸炎癥因子TNF-α 和INF-γ 濃度較對照組均增加，差異有顯著性(P ＜0.01 );MDRPA + 抗生素組炎癥因子濃度較MDR-PA + 禁食組、MDR-PA 組差異有顯著性(P ＜0.05 );MDR-PA+ 禁食組與MDR-PA 組的炎癥因子濃度無明顯差別(圖5 )。

3 討論

隨著各種侵入性操作和器官移植的推廣，尤其是抗菌素的廣泛應(yīng)用和病原菌的變遷，革蘭陰性桿菌感染率高，尤其是銅綠假單胞菌感染日益嚴(yán)重，且病情危重，死亡率高，治療困難［8］。長期以來，銅綠假單胞菌感染尚缺乏有效的解決策略。雖然已有建立有關(guān)銅綠假單胞菌感染的動物模型，但或者針對其他部位的感染，如建立大鼠［9］、小鼠［10，11］、兔［12］等銅綠假單胞菌肺部感染模型;或者是秀麗隱桿線蟲［13］、果蠅［14，15］腸道耐藥銅綠假單胞菌感染模型。以及Alverdy 等［16］研究銅綠假單胞菌在小鼠腸道定植致病與其凝集黏附素的關(guān)系，證實銅綠假單胞菌對腸道上皮的黏附性和破壞腸上皮屏障是引起腸道感染致死機(jī)制之一。近來，Zaborina 等［17］利用臨床株多重耐藥銅綠假單胞菌擾亂培養(yǎng)人類腸上皮細(xì)胞(Caco-2 )的完整性，研究其相關(guān)的毒性表型如黏附性、能動性、生物膜形成和細(xì)胞毒性。Long 等［18］研究經(jīng)過30%肝切除和短期禁食后的小鼠腸道粘液磷酸鹽顯著降低，在此基礎(chǔ)上并給予腸道接種銅綠假單胞菌，實驗證實小鼠腸道銅綠假單胞菌感染不僅與腸道低磷酸鹽環(huán)境有關(guān)，而且與銅綠假單胞菌破壞腸道上皮屏障有密切關(guān)系。

圖5 各組炎癥因子TNF-α(A)、TNF-γ(B)的比較Fig.5 A:Comparison of TNF-α of the 4 groups.B:Comparison of TNF-γ of the 4 groups

然而小鼠腸道多重耐藥銅綠假單胞菌感染的研究比較少見，本實驗運用臨床分離的多重耐藥銅綠假單胞菌，通過三種不同處理方法建立小鼠腸道銅綠假單胞菌感染模型。第一種方法是采用直接給小鼠菌液灌胃7d，小鼠表現(xiàn)出膿稀便，精神萎靡，體重減輕明顯，結(jié)腸組織病理示病變累及黏膜大部，炎癥中度，黏膜下層充滿炎癥細(xì)胞，腸道炎癥因子增高，在短期內(nèi)，腸道致病菌的數(shù)量迅速增長，益生菌菌群生長受到抑制，導(dǎo)致小鼠腸道相對穩(wěn)定的生態(tài)屏障被破壞，誘發(fā)腸道感染，為研究臨床急性腸道感染提供一種參考模型。由于臨床上廣泛應(yīng)用的抗生素，在殺滅病原微生物的同時也抑制了正常菌群中的有益微生物，使機(jī)體內(nèi)相對穩(wěn)定的生態(tài)屏障被破壞，導(dǎo)致腸道菌群紊亂［7］。第二種方法是先用廣譜抗生素三代頭孢菌素-頭孢曲松鈉干預(yù)小鼠3d 后，使小鼠腸道菌群失調(diào)癥狀(小鼠糞便呈軟便或稀便)，再給予菌液灌胃7d，這樣所灌細(xì)菌更加容易引起腸道感染，此方法較第一種方法引起的腸道炎癥更加嚴(yán)重，且于實驗第10 天，由于腸道感染嚴(yán)重，有黃膿便，小鼠體重明顯減輕，有一只小鼠死亡。不過此方法可以模擬臨床長期應(yīng)用廣譜抗生素的患者出現(xiàn)腸道感染的現(xiàn)象，為抗生素相關(guān)性腸道感染提供一個合適的研究模型。第三種方法是采用給小鼠禁食1d 后，再給予菌液灌胃7d，小鼠表現(xiàn)出膿稀便，精神萎靡，體重減輕明顯，結(jié)腸組織病理示病變累及黏膜大部，炎癥中度，黏膜下層充滿炎癥細(xì)胞，腸道炎癥因子增高。禁食造成的腸道黏膜萎縮［19］，使致病菌更易定植于腸道，誘發(fā)腸道感染。此方法可以模擬臨床常見的因長時間禁食造成的細(xì)菌定植、易位而引發(fā)的腸道感染。

本實驗中MDR-PA + 抗生素組小鼠糞便呈膿便，精神萎靡，體重明顯減輕較MDR-PA 組和MDRPA + 禁食組有差異;經(jīng)過處理的三組小鼠較對照組均出現(xiàn)炎癥因子的明顯升高和光鏡下炎癥病變，但MDR-PA + 抗生素組的小鼠的炎癥因子和炎癥評分較另外兩組升高明顯;鏡下觀察MDR-PA + 抗生素組的炎癥病變較其余兩組嚴(yán)重;細(xì)菌培養(yǎng)鑒定及藥敏結(jié)果均顯示與所灌胃時的細(xì)菌相一致，確定腸道多重耐藥菌感染的穩(wěn)定性，為研究臨床腸道感染提供可用的動物模型。

綜上所述，第一種方法建立模型簡便，直接灌菌液即可，但是引起的腸道感染癥狀較輕，若需要更嚴(yán)重的腸道感染模型，則要延長灌胃天數(shù)，這樣將會延長實驗進(jìn)程;第二種方法先用抗生素干擾，引起腸道菌群失調(diào)后，再給予菌液灌胃，這樣短期內(nèi)可以引起腸道重度感染模型，但是增加了實驗程序，可能會導(dǎo)致小鼠死亡。第三種方法相對較簡便，禁食后給予菌液灌胃，引起的腸道感染癥狀較第一種方法嚴(yán)重，但炎癥程度仍較輕，以后可以考慮同時禁食水或延長禁食時間，這樣引起的腸道感染癥狀可能會加重。

總之，本實驗三種方法均可成功建立腸道多重耐藥細(xì)菌感染動物模型，可根據(jù)不同實驗?zāi)康倪x擇不同的建立模型方法。

(本文圖2，3 見彩插7。)

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