闞微娜，滕艷坤，楊宏偉，隗 笑（遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所，沈陽(yáng) 110023）

DTDPA-PITC聯(lián)合柱前衍生化HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液中18種氨基酸的含量

闞微娜＊，滕艷坤，楊宏偉，隗 笑（遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所，沈陽(yáng) 110023）

目的：建立同時(shí)測(cè)定含有半胱氨酸或胱氨酸的復(fù)方氨基酸注射液中18種氨基酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，以二硫代二丙酸（DTDPA）和異硫氰酸苯酯（PITC）聯(lián)合作為柱前衍生化試劑。色譜柱為KromasilC18，流動(dòng)相[A為0.1mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 5.38）-乙腈（93∶7，V/V）、B為乙腈-水（80∶20，V/V），采用梯度洗脫]，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流速為1.0m l/m in，進(jìn)樣量為3μl，柱溫為35℃。結(jié)果：18種氨基酸在各自測(cè)定濃度的20%～180%的范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r≥0.999 0）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤1.91%；平均回收率在95.7%～99.7%之間，RSD≤1.99%（n＝9）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、高效，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)復(fù)方氨基酸注射液中半胱氨酸以及其他17種氨基酸的準(zhǔn)確定量。

二硫代二丙酸；異硫氰酸苯酯；柱前衍生化；高效液相色譜法；氨基酸；半胱氨酸

測(cè)定氨基酸含量方法很多，僅柱前衍生化測(cè)定氨基酸含量的方法就有近10種[1]。最常見(jiàn)的柱前衍生化方法為異硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯（AQC）法、鄰苯二醛和9-芴甲基氯甲酸甲酯（OPA-FMOC）聯(lián)用法以及2，4-二硝基氟苯（DNFB）法。AQC法和OPAFMOC法衍生化反應(yīng)時(shí)間短，專屬性較好，但衍生化試劑價(jià)格相對(duì)昂貴，衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要使用具備編程功能的自動(dòng)進(jìn)樣器，將樣品衍生化后立即進(jìn)樣，對(duì)儀器要求較高[2-3]。DNFB法所用的衍生化試劑屬易爆、劇毒物質(zhì)，有強(qiáng)致癌性，且極易損壞色譜柱，同時(shí)易干擾絲氨酸的測(cè)定[4]。PITC法與氨基酸和亞氨基酸均能反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定，衍生化試劑價(jià)格低廉，是最具吸引力的氨基酸分析方法之一。

半胱氨酸是多種復(fù)方氨基酸注射液[5-6]的主要成分之一，其不穩(wěn)定，與胱氨酸可以相互轉(zhuǎn)化，定量十分困難。很多復(fù)方氨基酸注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中并未對(duì)半胱氨酸的含量進(jìn)行規(guī)定。Barkholt曾提出用二硫代二丙酸（DTDPA）將半胱氨酸和胱氨酸氧化成同一特定的S-2-羧乙基硫代半胱氨酸（Cys-MPA），再對(duì)后者進(jìn)行定量分析[7]。本研究即采用DTDPA將半胱氨酸或胱氨酸氧化成為穩(wěn)定的氨基酸復(fù)合物，再以PITC法進(jìn)行柱前衍生化，通過(guò)優(yōu)化衍生化反應(yīng)影響因素，改善高效液相色譜（HPLC）條件，使之與其他氨基酸得到有效分離，從而同時(shí)測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液中18種氨基酸的含量。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，包括二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器、柱溫箱及LC-solution工作站（日本島津公司）；CP225D型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

氨基酸對(duì)照品（含門(mén)冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鹽酸賴氨酸，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140624-200805，谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，甲硫氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%，其他氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%）；L-鹽酸半胱氨酸對(duì)照品（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：073K8421，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）；復(fù)方氨基酸注射液（18AA-℃，遼寧某企業(yè)提供，批號(hào)：130102、130103、130104）；PITC（上海亭新化工廠，分析純）；DTDPA（美國(guó)安捷倫公司，分析純）；乙腈為色譜純，冰醋酸、無(wú)水醋酸鈉、硼酸為分析純，試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.1mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 5.38）-乙腈（93∶7，V/V），流動(dòng)相B為乙腈-水（80∶20，V/V），梯度洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0m l/min；進(jìn)樣量：3μl；柱溫：35℃。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 The gradient elution mode

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取各氨基酸對(duì)照品適量，用水溶解稀釋制成含異亮氨酸0.75mg/m l、亮氨酸1.0mg/m l、鹽酸賴氨酸0.62mg/m l、甲硫氨酸0.50 mg/m l、苯丙氨酸0.50 mg/m l、蘇氨酸0.25mg/m l、色氨酸0.25mg/m l、纈氨酸0.75mg/ m l、丙氨酸0.30mg/m l、精氨酸0.30mg/m l、門(mén)冬氨酸0.025mg/ m l、谷氨酸0.025mg/m l、組氨酸0.25mg/m l、脯氨酸0.20mg/ m l、絲氨酸0.10mg/m l、酪氨酸0.05mg/m l、甘氨酸0.15mg/m l、半胱氨酸0.025mg/m l的混合溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 精密量取樣品10m l，加水稀釋至100m l，即得（其中氨基酸質(zhì)量濃度與對(duì)照品溶液相同）。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按照復(fù)方氨基酸注射液（18AA-℃）的處方，稱取亞硫酸氫鈉2.5 g、冰醋酸7mg，加水稀釋至100m l，即得。

2.3 衍生化方法

精密量取對(duì)照品溶液0.5m l，精密加入10%DTDPA溶液（稱取DTDPA 1 g，用0.4mol/L硼酸緩沖液10m l溶解，并用40%氫氧化鈉溶液調(diào)pH至10.4）0.5m l，于80℃水浴放置30 m in，取出，精密加入0.2mol/LPITC乙腈溶液0.25m l、1mol/L三乙胺乙腈溶液0.25m l，混勻，于40℃水浴放置60m in（供試品溶液和陰性對(duì)照溶液同法操作）。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下衍生化方法處理后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果，陰性對(duì)照對(duì)氨基酸的測(cè)定無(wú)干擾。各種氨基酸色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)以門(mén)冬氨酸計(jì)為7 694。

圖1 DTDPA-PITC聯(lián)合柱前衍生化高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.門(mén)冬氨酸；2.谷氨酸；3.絲氨酸；4.甘氨酸；5.組氨酸；6.精氨酸；7.蘇氨酸；8.丙氨酸；9.脯氨酸；10.半胱氨酸；11.酪氨酸；12.纈氨酸；13.甲硫氨酸；14.異亮氨酸；15.亮氨酸；16.苯丙氨酸；17.色氨酸；18.賴氨酸Fig 1 Chromatographs of 18 kinds of am ino acids w ith pre-column DTDPA-PITC derivatizationA.sunstance control；B.test sample；C.negative control；1.aspartic acid；2.glutam ic acid；3.serine；4.glycine；5.histidine；6.arginine；7.threonine；8.alanine；9.proline；10.cysteine；11.tyrosine；12.valine；13.methionine；14.isoleucine；15.leucine；16.phenylalanine；17.trptophan；18.lysine

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取各氨基酸對(duì)照品適量，用水溶解稀釋，制成相當(dāng)于“2.2.1”項(xiàng)下各氨基酸測(cè)定濃度的20%、60%、100%、140%和180%的系列溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法衍生化，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入HPLC儀進(jìn)樣測(cè)定。以各組分峰面積（y）對(duì)其質(zhì)量濃度（x，mg/L）進(jìn)行線性回歸，回歸方程和線性范圍見(jiàn)表2。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法衍生化后重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定5次。結(jié)果，各氨基酸峰面積的RSD≤1.28%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（20130102）樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別放置0、4、8、12、16、20、24 h時(shí)按“2.3”項(xiàng)下方法衍生化后進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，各氨基酸峰面積的RSD≤1.91%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 回歸方程和線性范圍Tab 2 Regression equation and linear range

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（20130102）樣品適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別按“2.3”項(xiàng)下方法衍生化后進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，各氨基酸平均含量為94.0%～103.2%，RSD為0.82%～1.62%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

根據(jù)復(fù)方氨基酸注射液（18AA-℃）的處方，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液中各氨基酸測(cè)定濃度的80%、100%和120%制備回收率試驗(yàn)用系列溶液，每個(gè)濃度各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法衍生化后再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表3（注：由于數(shù)據(jù)量較大，每種氨基酸的加入量及測(cè)得量不在表中一一列出）。

2.10 樣品含量測(cè)定

分別取3批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法衍生化后再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各氨基酸含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）Tab 4 Content determ ination of samp les（n＝2）

3 討論

3.1 流動(dòng)相A中醋酸鹽緩沖液的pH及濃度對(duì)氨基酸分析的影響

PITC法使用的流動(dòng)相A中醋酸鹽緩沖液pH為6.5，在此pH下，半胱氨酸同DTDPA的氧化產(chǎn)物Cys-MPA與精氨酸峰位重合，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相梯度，也無(wú)法使二者實(shí)現(xiàn)較好的分離。故試驗(yàn)將流動(dòng)相A中醋酸鹽緩沖液的pH分別調(diào)節(jié)到6.01、5.72、5.49、5.43、5.38和5.30后，對(duì)各氨基酸峰及與Cys-MPA峰之間的分離度進(jìn)行了考察。結(jié)果，當(dāng)pH為5.38時(shí)，各氨基酸峰及與Cys-MPA峰之間的分離度良好，分離度均大于1.5。因此，流動(dòng)相A中醋酸鹽緩沖液的pH應(yīng)嚴(yán)格控制在5.38±0.02，否則Cys-MPA與其他組分或衍生試劑峰無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離。此外，流動(dòng)相A中醋酸鹽緩沖液的濃度也會(huì)影響各組分的分離度，因此在配制過(guò)程中也需要準(zhǔn)確控制。

3.2 DTDPA對(duì)氨基酸分析的影響

取兩份混合對(duì)照溶液各0.5m l，第1份加10%DTDPA溶液0.5m l，第2份加水0.5m l，前者于80℃水浴放置30m in取出后，采用PITC法衍生化，后者直接采用PITC法衍生，比較除半胱氨酸外其他各氨基酸測(cè)定的峰面積及保留時(shí)間。結(jié)果，DTDPA的加入對(duì)其他氨基酸的測(cè)定基本沒(méi)有影響。DTDPA反應(yīng)結(jié)束加入PITC試劑后，溶液分層，振搖混勻后會(huì)出現(xiàn)輕微的混濁或有油滴出現(xiàn)，待到衍生化反應(yīng)完全，溶液即會(huì)澄清，因此溶液澄清與否可以作為衍生化反應(yīng)是否完全的一個(gè)判斷依據(jù)。

3.3 PITC濃度及反應(yīng)溫度的影響

PITC乙腈溶液的濃度高于0.2mol/L，衍生化反應(yīng)的溫度高于40℃，并不會(huì)對(duì)氨基酸的響應(yīng)值有顯著的影響，但得到的測(cè)定溶液的顏色卻加深明顯，推測(cè)可能有更多的衍生化副產(chǎn)物生成。因此，PITC法的衍生化試劑濃度及反應(yīng)溫度應(yīng)盡量嚴(yán)格控制。

3.4 色譜柱的保護(hù)

PITC法衍生化試劑會(huì)使色譜柱填料過(guò)早老化，連續(xù)使用會(huì)導(dǎo)致柱效下降顯著。故使用時(shí)，可在上柱前增加一根具有C18填料的預(yù)柱，以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。

3.5 其他

半胱氨酸的水溶液極其不穩(wěn)定，一般需要使用強(qiáng)氧化劑將其氧化為穩(wěn)定的化合物后再進(jìn)行定量測(cè)定。目前，半胱氨酸多使用過(guò)甲酸將其氧化為磺基丙氨酸后再用氨基酸分析儀進(jìn)行分析。但是，氨基酸分析儀用途單一，儀器和耗材的價(jià)格昂貴，不適用于企業(yè)質(zhì)控[8]。本研究采用DTDPA為氧化劑，與PITC聯(lián)合作為柱前衍生化試劑使用，不但可以準(zhǔn)確測(cè)定產(chǎn)品中半胱氨酸的含量，且不影響其他氨基酸的測(cè)定，為企業(yè)質(zhì)控帶來(lái)方便，也可為復(fù)方氨基酸注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供新途徑。

[1]美國(guó)藥典委員會(huì).美國(guó)藥典：34版[S].華盛頓：美國(guó)藥典委員會(huì)，2012：568-573.

[2]陸明，孫黛妮，汪楊，等.OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生化法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液中氨基酸的含量[J].藥物分析雜志，2012，32（6）：1 085.

[3] 陳宇堃，梁蔚陽(yáng)，薛巧如，等.AccQ-Tag法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液（18AA-℃））中17種氨基酸的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，24（2）：243.

[4]瞿其曙，湯曉慶，胡效亞，等.柱前衍生化法在氨基酸分析測(cè)定中的應(yīng)用[J].化工進(jìn)展，2006，18（6）：789.

[5] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.復(fù)方氨基酸注射液（18AA-℃）：WS1-XG-022-2011[S].2011.

[6] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.復(fù)方氨基酸注射液（18AA-℃）：YBH02452010[S].2010.

[7] 夏蘇捷，邵泓，陳鋼.柱前衍生化HPLC法測(cè)定醬油中（半）胱氨酸的含量[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2008，20（4）：304.

[8]闞微娜，王滬凱.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液（9AA）中抗氧劑的含量[J].中國(guó)生化藥物雜志，2012，33（6）：833.

Simultaneous Determ ination of 18 Kinds of Am ino Acids in Compound Am ino Acid Injection by DTDPA-PITC Combined w ith Pre-column Derivatization HPLC

KAN Wei-na，TENG Yan-kun，YANG Hong-wei，KUI Xiao（Liaoning Institute for Food and Drug Control，Shenyang 110023，China）

OBJECTIVE：To develop amethod for simultaneous determination of 18 kinds of amino acids in Compound amino acid injection including cysteine or cystine.METHODS：HPLC method was adopted.The sampleswere derived w ith 3，3’-dithiodipropionic acid（DTDPA）and phenylisothiocyanate（PITC）.The determination was performed on Kromasil C18column w ith mobile phase A consisted of 0.1 mol/L acetate buffer（pH 5.38）-acetonitrile（93∶7，V/V）and mobile phase B consisted of acetonitrile-water（80∶20，V/V）at the flow rate of 1.0 m l/m in（gradient elution）and the detection wavelength of 254 nm.The column temperature was 35℃，and the injection volume was 3μl.RESULTS：The linear range of 18 kinds of am ino acids was 20%-180%（r≥0.999 0）；RSDs of precision，stability and reproducible were≤1.91%；average recoveries were 95.7%-99.7%（RSD≤1.99%，n＝9）.CONCLUSIONS：Themethod can accurately and efficiently determ ine cysteine and other 17 kinds of am ino acids in simultaneously.

3，3’-dithiodipropionic acid；Phenylisothiocyanate；Pre-column derivatization；HPLC；Am ino acids；Cysteine

R917

A

1001-0408（2014）12-1122-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.12.23

＊主管藥師，碩士。研究方向：生化藥物分析。電話：024-25425029。E-mail：kanweina@126.com

2013-05-10

2014-02-07）