謝啟應(yīng)，鐘巧青，謝秀梅，楊天倫，陳美芳

血管緊張素Ⅱ通過上調(diào)白細(xì)胞介素-8受體表達(dá)增加單核細(xì)胞黏附*

謝啟應(yīng)，鐘巧青△，謝秀梅，楊天倫，陳美芳

目的：探討血管緊張素II (Ang II）對(duì)單核細(xì)胞黏附的影響及機(jī)制研究。

方法： Ang II (10-6M） 培養(yǎng)人單核細(xì)胞株4 h或24 h，并加入氯沙坦 (1, 3, 10 μM）或抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC，10 μM），檢測單核細(xì)胞內(nèi)活性氧 (ROS）水平、單核內(nèi)皮細(xì)胞黏附、上清液中白細(xì)胞介素-8 (IL-8）、腫瘤壞死因子α (TNF-α）水平、單核細(xì)胞的白細(xì)胞介素-8受體（CXCR2 ）mRNA表達(dá)以及核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB）和活化蛋白（AP-1） 的活性。

結(jié)果： Ang II (10-6M）孵育單核細(xì)胞后顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平、上清液中白細(xì)胞介素-8和腫瘤壞死因子α水平，單核細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κB和AP-1的活性以及上調(diào)CXCR2 mRNA表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞。預(yù)先給予氯沙坦呈濃度依賴性的抑制Ang II誘導(dǎo)的上述反應(yīng)，抗氧化劑PDTC同樣抑制Ang II誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和單核細(xì)胞黏附。

結(jié)論：Ang II通過上調(diào)CXCR2表達(dá)，增加單核細(xì)胞黏附，活化單核細(xì)胞促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，這一過程涉及ROS-NF-κB/AP-1通路。

血管緊張素II；單核細(xì)胞；白細(xì)胞介素-8；趨化因子受體

(Chinese Circulation Journal, 2014, 29: 367.)

單核細(xì)胞黏附到受損的內(nèi)皮細(xì)胞繼而進(jìn)入血管內(nèi)膜下組織是動(dòng)脈粥樣硬化早期發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究顯示白細(xì)胞介素-8（IL-8）屬于趨化因子（chemokine）CXC家族，其對(duì)單核細(xì)胞穩(wěn)定地黏附到內(nèi)皮細(xì)胞起到重要作用。有研究報(bào)道不穩(wěn)定性心絞痛患者的白細(xì)胞介素-8水平明顯升高[1]；敲除白細(xì)胞介素-8的受體（CXCR2）后，斑塊病變和單核巨噬細(xì)胞的聚集均明顯減輕[2]。血管緊張素II（Ang II）是一種重要的致炎因子，它可誘導(dǎo)單核細(xì)胞增殖、游走，并促使單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。早期研究報(bào)道Ang II可上調(diào)CXC趨化因子表達(dá)，而使用CXCR2拮抗劑SB-517785-M幾乎可完全逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)[3]。然而有關(guān)Ang II對(duì)單核細(xì)胞趨化因子的影響的相關(guān)研究報(bào)道少見，本實(shí)驗(yàn)擬觀察Ang II對(duì)單核細(xì)胞黏附的影響及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

材料：人單核細(xì)胞株（THP-1，ATCC）購自湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)中心。人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC-12，ATCC，CRL-2480）購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所。Ang II、胰酶、抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC）購自Sigma公司（圣路易斯，美國）；氯沙坦由美國默沙東公司饋贈(zèng)；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM系Gibco產(chǎn)品（加利福尼亞，美國）；小牛血清購自杭州四季青；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素8試劑盒購自上海森雄生物有限公司；RT試劑盒購自Fermentas（安大略省柏林頓，加拿大）；引物由上海生工技術(shù)有限公司合成。[γ-32P] ATP由北京福瑞生物工程公司提供；活性氧檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，總RNA抽提試劑TRIzol、核轉(zhuǎn)錄因子κB （NF-κB）和活化蛋白（AP-1）探針，凝膠遷移系統(tǒng)購自Promega公司（麥迪遜，美國）。

人單核細(xì)胞的培養(yǎng)和處理：取THP-1細(xì)胞株，解凍復(fù)蘇后加入含15%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃）。1%血清處理24 h后將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行不同處理?？瞻讓?duì)照組：用含1%小牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育4 h或24 h；Ang II組：用含10-6M的Ang II的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞4 h或24 h；氯沙坦（1, 3, 10 μM）組：1, 3, 10 μM的氯沙坦孵育1 h后加入10-6M的Ang II繼續(xù)培養(yǎng)4 h或24 h；PDTC組：加入終濃度為10 μM的PDTC孵育1.5 h后加入10-6M的Ang II繼續(xù)培養(yǎng)4 h或24 h。

細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測[4]：將THP-1細(xì)胞接種于24孔板（104個(gè)/m l），孵育24～48 h待細(xì)胞融合經(jīng)1%血清處理后加入不同干預(yù)因素，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，棄去培養(yǎng)液，室溫下D-Hank’s液漂洗3次，加入10 μM H2DCF-DA熒光探針，37℃避光孵育20 min，D-Hank’s漂洗3次后加入1 m l 無血清的培養(yǎng)液，30 min后用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為535 nm。

細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 將THP-1細(xì)胞進(jìn)行處理后加入6孔板未處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中（每孔1 ml），37℃振蕩孵育30 min，用Hanks平衡液小心沖洗掉未粘附的單核細(xì)胞。用3%的多聚甲醛每孔200 μl固定，然后在倒置高倍顯微鏡下每孔隨機(jī)選擇6個(gè)視野（hpf）計(jì)數(shù)黏附的單核細(xì)胞數(shù)目。

白細(xì)胞介素-8、腫瘤壞死因子α含量的測定：嚴(yán)格按照試劑盒的要求[5]，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定白細(xì)胞介素-8、腫瘤壞死因子α，在含有抗體包被的96孔板，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各100 μl，37℃孵育 2 h，洗板 5 次，每孔加入 100 μl酶標(biāo)二抗，37℃溫育1 h，洗板5次，加入底物100 μl，37℃閉光孵育15 min，每孔加入終止液1滴，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光值，計(jì)算出白細(xì)胞介素-8的濃度?；蛴妹笜?biāo)儀在450 nm處測定吸光值，計(jì)算出腫瘤壞死因子α的濃度。

CXCR2 mRNA表達(dá)：采用Trizol法提取總RNA，取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后取2 μl行多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)。CXCR2上游引物：5’-CGGAATTCAA ATGGAAGATTTTAACATGGAG-3’。下游引物：5’-CC GCTCGAGTTAGAGAGTAGTGGAAGTGTG-3’，擴(kuò)增片段長度為417 bp。PCR反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件為94°C變性60 s，58°C退火60 s，72°C延伸60 s，38個(gè)循環(huán)。β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）上游引物：5’-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3’，下游引物：5’-ATGTCACGCACGATTTCC-3’，擴(kuò)增片段長度為218 bp。PCR反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件為94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸60 s，28個(gè)循環(huán)。得到的多聚酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物2%的瓊脂糖電泳并用成像系統(tǒng)掃描攝片。

電泳遷移率改變檢測法（EMSA）分析核轉(zhuǎn)錄因子κB、AP-1活性 嚴(yán)格按照Promega公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行操作[6]。提取核蛋白用BCA法[7]檢測提取液中核蛋白濃度。核轉(zhuǎn)錄因子κB同序寡核苷酸探針序列為3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’；5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’。AP-1探針序列為5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3'，3'- AAC TAC TCA GTC GGC CTT TGC-5'。采用T4寡核苷酸激酶法以[γ-32P] ATP （10 μCi/μl）進(jìn)行末端同位素標(biāo)記，游離探針用G-25層析法除去。蛋白 -DNA 結(jié)合反應(yīng)在總?cè)萘?10 μl含有 8～10 μg核抽提物，4% glycerol，1 mM MgCl2，0.5 mM依地酸，0.5 mM DTT，50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl pH 7.5 和 1 μg poly（di-dc）的液體中于室溫下反應(yīng)10 min。然后加入50 000～200 000 cpm標(biāo)記探針入反應(yīng)液中室溫下繼續(xù)孵育20 m in。在4%非變性聚丙烯酰胺電泳30 m in左右（電壓350 V，電泳緩沖液為0.5×TBE） 后干膠，置-70 ℃放射自顯影24 h。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，雙側(cè)P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管緊張素II對(duì)單核細(xì)胞黏附的影響（表1）

表1 血管緊張素II對(duì)單核細(xì)胞黏附的影響（n =4，±s）

表1 血管緊張素II對(duì)單核細(xì)胞黏附的影響（n =4，±s）

注：與空白對(duì)照組相比*P＜0.01；與血管緊張素Ⅱ組比△P＜0.01

組別 黏附的單核細(xì)胞數(shù) (高倍鏡)空白對(duì)照組 139 ± 20血管緊張素Ⅱ組 449 ± 38*氯沙坦組1 μM 238 ± 20△3 μM 201 ± 15△10 μM 192 ± 15△吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽組 242 ± 23△

Ang II培養(yǎng)單核細(xì)胞24 h ，Ang II組與空白對(duì)照組比，顯著增加黏附到內(nèi)皮細(xì)胞上的單核細(xì)胞數(shù)（P＜0.01），與 Ang II組比較氯沙坦（1，3，10 μM）組、PDTC組可明顯減少黏附到內(nèi)皮細(xì)胞上的單核細(xì)胞數(shù)（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 血管緊張素II對(duì)單核細(xì)胞CXCR2 mRNA表達(dá)的影響

Ang II刺激單核細(xì)胞4 h， Ang II組可上調(diào)CXCR2 mRNA表達(dá)（P＜0.01），氯沙坦（1，3，10 μM）組和PDTC組均可下調(diào)Ang II 誘導(dǎo)的CXCR2 mRNA表達(dá)（P＜0.01）。圖1

2.3 血管緊張素II對(duì)單核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中白細(xì)胞介素-8、腫瘤壞死因子α水平的影響

Ang II培養(yǎng)單核細(xì)胞24 h ，Ang II組上清液中白細(xì)胞介素-8和腫瘤壞死因子α的含量與空白對(duì)照組比顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；氯沙坦（1, 3, 10 μM）組和PDTC組白細(xì)胞介素-8（圖2A）、腫瘤壞死因子α（圖2B）水平與Ang II組比含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, P＜0.01）。

2.4 血管緊張素II對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的影響

Ang II培養(yǎng)單核細(xì)胞4 h，Ang II組較空白對(duì)照組顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS生成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。氯沙坦（1, 3, 10 μM）組和PDTC組ROS水平與Ang II組比顯著降低（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2C）。

2.5 血管緊張素II對(duì)單核細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB和活化蛋白-1活性的影響

圖2 血管緊張素Ⅱ?qū)ι锨逡褐邪准?xì)胞介素-8（2A）、腫瘤壞死因子（2B）及細(xì)胞內(nèi)活性氧（2C）生成的影響（n=6）

電泳遷移率改變檢測法（EMSA）結(jié)果所示，陰性對(duì)照組（沒有加任何核蛋白）沒有任何信號(hào)條帶顯影。與對(duì)照組相比，Ang II培養(yǎng)單核細(xì)胞4 h明顯增加核轉(zhuǎn)錄因子κB（圖3A）和AP-1（圖3B）的活性。氯沙坦（1, 3, 10 μM）組、PDTC組核轉(zhuǎn)錄因子κB和AP-1活性較Ang II組明顯降低。

圖3 電泳遷移率改變檢測法分析血管緊張素Ⅱ?qū)魏思?xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB（圖3A）和活化蛋白（圖3B）活性的影響（n=3）

3 討論

大量研究顯示Ang II通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促進(jìn)炎癥介質(zhì)和趨化因子的釋放，促進(jìn)單核細(xì)胞活化，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。有研究報(bào)道，Ang II能增加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶活性或表達(dá)促進(jìn)ROS形成，增加斑塊的不穩(wěn)定性，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[8]。國內(nèi)有研究報(bào)道Ang II可呈時(shí)間和濃度依賴性的增加內(nèi)皮細(xì)胞超氧陰離子的生成，纈沙坦可阻斷Ang II的這一作用[9]，說明氧化應(yīng)激在Ang II誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程中起著非常重要的作用。

單核細(xì)胞遷移黏附到血管內(nèi)皮的過程中趨化因子起了至關(guān)重要的作用。研究顯示，白細(xì)胞介素-8可趨化新鮮分離的外周血單核細(xì)胞，促進(jìn)單核細(xì)胞在流動(dòng)的條件下穩(wěn)定地黏附于血管內(nèi)皮。CXCR2受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，與白細(xì)胞介素-8結(jié)合可幫助單核細(xì)胞穩(wěn)定黏附到內(nèi)皮細(xì)胞。研究報(bào)道，冠心病患者外周血CXCR2表達(dá)上調(diào)[10]；在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展期的粥樣斑塊巨噬細(xì)胞富集區(qū)CXCR2明顯表達(dá)，敲除CXCR2受體后，斑塊病變和單核巨噬細(xì)胞的聚集均明顯減輕[2]。在佛波醇誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞株細(xì)胞，氯沙坦可抑制Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子表達(dá)上調(diào)[11]。在體研究報(bào)道，大鼠腹腔注射Ang II可顯著增加CXC趨化因子的水平，上調(diào)CXCR2的mRNA表達(dá)，增加中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞募集，而給予CXCR2阻斷劑SB517785-M可抑制這一過程[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ang II能顯著增加單核細(xì)胞內(nèi)ROS生成，增加下游炎癥因子白細(xì)胞介素-8、腫瘤壞死因子α，上調(diào)趨化因子受體CXCR2誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附，預(yù)先給予氯沙坦或PDTC可阻斷Ang II的作用，提示Ang II通過其受體誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激介導(dǎo)了單核細(xì)胞黏附，這一過程與激活I(lǐng)L-8/CXCR2系統(tǒng)有關(guān)。

到目前為止，Ang II誘導(dǎo)趨化因子和炎癥因子表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑尚不明確。然而，有越來越多的證據(jù)支持核轉(zhuǎn)錄因子κB和AP-1可能協(xié)同參與這一過程。研究報(bào)道各種炎癥刺激包括Ang II、脂多糖、促炎細(xì)胞因子、氧自由基、病毒等都能活化AP-1；Ang II通過活化核轉(zhuǎn)錄因子κB通路，從而誘導(dǎo)大量炎癥基因如白細(xì)胞介素-8、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β的轉(zhuǎn)錄[13]。Schmeisser等[14]報(bào)道Ang II增加單核細(xì)胞白細(xì)胞介素-8的表達(dá)，氯沙坦可通過降低核轉(zhuǎn)錄因子κB活性阻斷Ang II 的作用。本研究發(fā)現(xiàn)Ang II通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，激活核轉(zhuǎn)錄因子κB和AP-1，誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附，而氯沙坦或抗氧化劑PDTC可抑制這一過程，提示Ang II通過激活ROS-NF-κB/AP-1信號(hào)通路上調(diào)白細(xì)胞介素8/CXCR2表達(dá)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附。氯沙坦通過其抗氧化和抗炎癥特性抑制Ang II所致的單核細(xì)胞活化，這也可能是氯沙坦新的抗動(dòng)脈粥樣硬化的新機(jī)制之一，值得進(jìn)一步深入探討。

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（編輯：常文靜）

Angiotensin Ⅱ Increasing the Monocyte Adhesion Via Up-regulating IL-8 Receptor CXCR2 Expression

XIE Qi-ying, ZHONG Qiao-qing, XIE Xiu-mei, YANG Tian-lun, CHEN Mei-fang.
Department of Geriatric Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha (410008), Hunan, China

CHEN Mei-fang, Email: meifang121@sohu.com

Objective: To explore the effect of angiotensin II (Ang II) increasing the monocyte adhesion w ith the possible molecular mechanism.

Methods: The experimental human monocytoid cells (THP-1) were cultured in 4 groups, each group contained 1×106cells. ① Blank control group, the cells were cultured for 4h or 24 h. ② Ang II treated group, the cells were cultured w ith Ang II (10-6M) for 4h or 24 h. ③Losartan treated group, the cells were cultured w ith losartan (1, 3, 10)μM for 1 hour and followed-by Ang II (10-6M) for 4h or 24 h. ④ PDTC group, cells were cultured w ith the anti oxidative agent PDTC 10 μM for 1.5 h and followed by Ang II (10-6M) for 4h or 24 h. The intracellular reactive oxygen species(ROS), the levels of interleukin-8 (IL-8), tumor necrosis factor (TNF-α) in the medium and the adhesion of monocyte to endothelial cells were exam ined. The expression of CXCR2 mRNA, nuclear factor kappaB (NF-κB) activity and activated protein (AP-1) were determ ined and compared among different groups.

Results: Compared w ith Blank control group, the Ang II treated group had signifi cantly elevated intracellular ROS,IL-8 and TNF-α, more monocyte adhesion to endothelial cells, higher expression of CXCR2 mRNA, increased activity of NF-κB and AP-1. The above Ang II induced up-regulations were inhibited by losartan in a dose-dependent manner. PDTC may also inhibit the Ang II induced oxidative stress and monocyte adhesion.

Conclusion: Ang II activates monocyte for developing atherosclerosis via up-regulating IL-8 receptor CXCR2 expression, which m ight be involved in ROS-NF-κB/AP-1 pathway.

Angiotensin II; Monocyte; Interleukin-8; Chemokine receptor

省科技廳課題（編號(hào)：2008FJ4183）；湖南省衛(wèi)生廳課題（編號(hào)：B2010-013）

410008 湖南省長沙市，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 老干科（謝啟應(yīng)、謝秀梅、楊天倫、陳美芳）；4230003 湖南省，郴州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科（鐘巧青）

謝啟應(yīng) 副教授 博士 主要從事心臟電生理研究 Email： eagledoctor@163.com△鐘巧青為并列第一作者 通訊作者：陳美芳Email： meifang121@sohu.com

R54

A

1000-3614（2014）05-0367-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.05.013

2013-09-13）