王春暉，喬寵，周文平，麻樹仁

（1.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科，沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；3.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)鏡中心，沈陽 110016）

KiSS?1基因?qū)θ艘认侔〤apan?2細(xì)胞的增殖及侵襲的影響

王春暉1，喬寵2，周文平1，麻樹仁3

（1.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科，沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；3.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)鏡中心，沈陽 110016）

目的研究KiSS?1基因?qū)θ艘认侔〤apan?2細(xì)胞增殖、侵襲的影響。方法 經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染上調(diào)Capan?2細(xì)胞中KiSS?1基因的表達(dá)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測Capan?2細(xì)胞中KiSS?1mRNA及其蛋白肽metastin的表達(dá)。采用MTT法分析KiSS?1對Capan?2細(xì)胞增殖能力的影響；Matrigel鋪被的transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測KiSS?1對Capan?2細(xì)胞侵襲能力的作用。結(jié)果KiSS?1轉(zhuǎn)染Capan?2細(xì)胞36hKiSS?1mRNA開始增多，到48hKiSS?1mRNA及其蛋白肽metastin表達(dá)明顯增強(qiáng)，達(dá)到峰值。與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組相比，KiSS?1轉(zhuǎn)染Capan?2細(xì)胞48h后，細(xì)胞體外侵襲能力顯著下降，侵襲指數(shù)顯著降低（P均<0.01），侵襲力抑制率達(dá)到56.5%（P均<0.01），但轉(zhuǎn)染KiSS?1對Capan?2細(xì)胞增殖能力無明顯影響（P均>0.05）。結(jié)論KiSS?1是胰腺癌的轉(zhuǎn)移抑制基因，可作為基因治療的新靶點(diǎn)。

KiSS?1；胰腺癌；增殖；侵襲

胰腺癌是預(yù)后最差的消化道惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率逐年上升，目前胰腺癌已占我國腫瘤相關(guān)死亡率的第六位。盡管研究者已經(jīng)從多個角度進(jìn)行胰腺癌的相關(guān)研究，但是由于胰腺癌具有局部侵襲力高、早期轉(zhuǎn)移局部淋巴結(jié)等特點(diǎn)，大多數(shù)胰腺癌在獲得診斷時(shí)已是局部進(jìn)展性或發(fā)生轉(zhuǎn)移，不但使胰腺癌患者在就診時(shí)就喪失根治性手術(shù)的機(jī)會，同時(shí)也是根治術(shù)后患者死亡的主要原因［1］。因此胰腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究及抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療成為近年來研究熱點(diǎn)之一。KiSS?1是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其編碼的蛋白肽metastin含有54個氨基酸。本課題組從人類正常胰腺組織中克隆該基因并成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體［2］。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)KiSS?1及其蛋白肽metastin表達(dá)降低與胰腺癌的TNM分期及侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。提示KiSS?1基因及其蛋白metastin可能在胰腺癌進(jìn)展過程中起到轉(zhuǎn)移抑制的作用，但是目前對KiSS?1基因抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)制仍不十分清楚。本研究中以中等轉(zhuǎn)移活性的人胰腺癌Capan?2細(xì)胞系作為研究對象，通過轉(zhuǎn)染上調(diào)KiSS?1基因及其蛋白的表達(dá)，并探討KiSS?1對胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響，為胰腺癌轉(zhuǎn)移基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌細(xì)胞Capan?2細(xì)胞系，PcDNA?3/KiSS?1真核表達(dá)質(zhì)粒由本室保存；RPM1640培養(yǎng)基、胎牛血清及青霉素、鏈霉素均購自Gibco公司；TRIzol Re?agent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；SYBRGreen mix購自BIO?RAD公司；BCA蛋白分析試劑盒購自Thermo Fisher公司；兔抗人metastin（1?54）購自Phoenix公司、兔抗人β?actin抗體購自Abcam公司、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Amersham公司、X?ray膠片、顯影劑、定影劑購自Kodak公司。Transwell小室、Matrigel和FN均購自BD公司；引物序列由大連寶生物公司合成，由Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)。其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Capan?2細(xì)胞系使用含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)基，添加1%的青霉素、鏈霉素，置于37℃、5%CO2、相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48～72h換液1次，用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化，按1∶4或1∶5比例傳代，在對數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到約90%時(shí)，按轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組）和不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，僅用脂質(zhì)體處理（空白對照組）的細(xì)胞作為對照。細(xì)胞以8×105/孔接種在六孔板中，轉(zhuǎn)染12h后換液，加入含有抗生素的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.4 Real?time PCR檢測KiSS?1mRNA的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后24h、36h和48h的上述各組細(xì)胞，用TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用ABI7300熒光定量PCR儀按SYBRGreen mix說明書進(jìn)行檢測。預(yù)變性95℃3min，變性95℃15s，退火延伸60℃1min，在60℃讀取數(shù)據(jù)；共40個循環(huán)。KiSS?1上游引物為5′?ACT?CACTGGTTTCTTGGCAGCT?3′，下游引物為 5′?CAGAGGCCACCTTTTCTAATGG?3′；內(nèi)參照β?actin上游引物為5′?ACCAACTGGGACGACATGGAGAAAA?3′，下游引物為5′?TACGGCCAGAGGCGTACAGGGATAG?3′。Real?time PCR總反應(yīng)體系為25μL，其中 cDNA2.5μL（100ng），SYBR?Green Realtime PCRMaster Mix 12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL。采用2-△△Ct法分析目的基因mRNA的相對表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測metastin的表達(dá)

同上分別收集轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后24h、36h和48h上述各組細(xì)胞，取適量RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上孵育30min，4℃12000g離心30min，取上清。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。以50μg蛋白樣品/泳道上樣，15%的SDS?PAGE膠電泳分離，電泳結(jié)束后將PAGE膠上的蛋白用Bio?Rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)于4℃200mA電轉(zhuǎn)移60min至PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的TBST室溫?fù)u床封閉2h.將然后用含5%脫脂奶粉的TBST稀釋相應(yīng)的一抗（兔抗人metastin 1∶500，兔抗人β?actin（1∶1000），將PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5min/次，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗用封閉液1∶20000稀釋，室溫?fù)u床孵育1h，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5min/次。每張膜滴加適量的ECL底物液，孵育數(shù)分鐘。待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X線膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。用BIO?RADQuantity One軟件掃描膠片灰度值，以metastin/β?actin的相對表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞增殖

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種細(xì)胞，3×103/孔，每孔體積100μL，設(shè)6個復(fù)孔，同上轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)24h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），孵育4h，終止培養(yǎng)，去上清，每孔加入100μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩10min。選擇490nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔的吸光值，記錄結(jié)果。連續(xù)檢測5d，測得的數(shù)據(jù)以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長曲線。

1.7 Matrigel鋪被的Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力變化

于Transwell小室濾膜內(nèi)表面均勻涂布Matrigel，20μg/孔，外表面涂FN5μg/孔，37℃放置3h，于上下兩個小室加入無血清培養(yǎng)基，并放置于培養(yǎng)箱中水化2h。傾去培養(yǎng)液后在下室加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，上室加入5×104/mL細(xì)胞懸液500μL（2.5×104/室），每種細(xì)胞做3個小室為平行樣，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)48h后取出，小心用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，染色，顯微鏡觀察、取10個視野，計(jì)數(shù)取平均值。以穿過無Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)作為對照，計(jì)算侵襲指數(shù)和侵襲力抑制率。侵襲指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%；細(xì)胞侵襲力抑制率=（對照組侵襲細(xì)胞數(shù)-實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)）/對照組侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞株中KiSS?1mRNA及其蛋白肽metastin的表達(dá)

Real?time PCR結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染前相比，轉(zhuǎn)染后36h，Capan?2細(xì)胞中KiSS?1mRNA表達(dá)增加，KiSS?1轉(zhuǎn)染Capan?2細(xì)胞36hKiSS?1mRNA開始增多，達(dá)到轉(zhuǎn)染前的 1.2倍（P<0.01），而到 48hKiSS?1mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，并達(dá)到峰值，為轉(zhuǎn)染前的1.9倍（P<0.01，圖1）。 Western blot顯示轉(zhuǎn)染前Capan?2細(xì)胞中幾乎檢測不到KiSS?1的蛋白肽metastin的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后36h，metastin開始增多，到48h metast?in表達(dá)明顯增加（圖2）。

2.2 轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞株Capan?2增殖能力的變化

MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染KiSS?1的Capan?2細(xì)胞株與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空白對照組相比，增殖活性未見明顯差異（P>0.05），空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空白對照組相比增殖活性也無明顯差異（P>0.05，圖3）。

2.3 KiSS?1轉(zhuǎn)染抑制胰腺癌細(xì)胞株Capan?2的侵襲能力

結(jié)果表明，成功轉(zhuǎn)染外源性KiSS?1基因的胰腺癌細(xì)胞Capan?2穿透Matrigel基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空白對照組細(xì)胞（P均<0.01）（圖4），侵襲指數(shù)顯著降低（P均<0.01，圖5），侵襲力抑制率達(dá)到56.5%，顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空白對照組細(xì)胞（P均<0.01，圖6）?？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空白對照組細(xì)胞相比，侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)無明顯差異（P>0.05）。

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者1年生存率低于20%，5年生存率小于5%［4］，高度轉(zhuǎn)移性是胰腺癌難以緩解并最終死亡的主要原因。近年來胰腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究及抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療成為研究熱點(diǎn)，目前關(guān)于胰腺癌中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的研究尚少。KiSS?1基因?yàn)橐环N腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，最初由Lee等在人類惡性黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)［5］，Ohtaki等利用定量PCR研究發(fā)現(xiàn)KiSS?1mRNA主要表達(dá)在胎盤組織中，其次在睪丸、胰腺、肝臟、小腸和腦組織中［6］。本課題組在2005年在國際上首次從人類正常胰腺組織中成功克隆KiSS?1基因，并成功構(gòu)建了KiSS?1真核表達(dá)質(zhì)粒［2］。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)人類胰腺癌組織中KiSS?1mRNA的表達(dá)顯著低于正常胰腺組織，其表達(dá)與臨床TNM分期、有無轉(zhuǎn)移和神經(jīng)侵犯密切相關(guān)［7］，但與組織學(xué)分級無關(guān)，表明胰腺癌的轉(zhuǎn)移與KiSS?1的低表達(dá)可能有關(guān)，但具體機(jī)制不清。

為此，我們選取了幾乎沒有KiSS?1表達(dá)的、具有中等轉(zhuǎn)移活性的胰腺癌細(xì)胞株Capan?2作為研究模型，采用轉(zhuǎn)染的方法使KiSS?1基因過表達(dá)，研究KiSS?1基因?qū)σ认侔┘?xì)胞增殖和侵襲能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)KiSS?1基因轉(zhuǎn)染后，KiSS?1mRNA和metastin的表達(dá)明顯增加，胰腺癌細(xì)胞Capan?2的增殖能力無明顯改變，表明KiSS?1基因及其蛋白肽metastin對胰腺癌細(xì)胞Capan?2的增殖能力無明顯作用［8］。這與KiSS?1基因在黑色素瘤中作用是一致的［5，9］。但還有研究發(fā)現(xiàn)KiSS?1過表達(dá)可抑制胃癌BGC?823細(xì)胞的增殖能力。目前認(rèn)為KiSS?1對于腫瘤細(xì)胞的增殖的作用是有細(xì)胞特異性的。Masui等在胰腺癌細(xì)胞株AsPC?1和PANC?1細(xì)胞培養(yǎng)液中添加外源性的metastin，發(fā)現(xiàn)外源性的metastin對于這兩種細(xì)胞株的增殖能力無影響［8］，因此可以推測在胰腺癌中KiSS?1及其蛋白肽metastin并不能抑制原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞的生長。

本研究發(fā)現(xiàn)KiSS?1基因轉(zhuǎn)染后體外培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞Capan?2侵襲能力顯著下降，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑本身對胰腺癌細(xì)胞株的侵襲能力無影響，說明KiSS?1基因過表達(dá)對于胰腺癌轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用。但是Masui等研究發(fā)現(xiàn)了一個奇怪的現(xiàn)象：當(dāng)外源性給予metastin時(shí)，對于胰腺癌細(xì)胞株AsPC?1的遷移并不受metastin的影響，而PANC?1細(xì)胞的遷移則被1μmol/L和10μmol/L的metastin所抑制，而且這兩種細(xì)胞株的侵襲能力并不受metastin的影響［8］。他們認(rèn)為外源性給予metast?in對于胰腺癌細(xì)胞的遷移抑制與其表達(dá)的受體GPR54水平有關(guān)，且無明顯侵襲抑制效應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)KiSS?1基因在不同的腫瘤細(xì)胞中發(fā)生的作用及其機(jī)制均不同，如在膀胱上皮腫瘤KiSS?1基因通過降低NFkB與MMP?9啟動子的結(jié)合，來抑制MMP?9基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而減少M(fèi)MP?9的合成，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞機(jī)動性、趨化性和侵襲性的作用［11］。在胃癌中KiSS?1則通過活化p38MAP激酶來抑制MMP?9的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲［10］。因此我們認(rèn)為在本研究中KiSS?1過表達(dá)對于Capan?2的侵襲能力的抑制，應(yīng)該是KiSS?1mRNA增加的效應(yīng)，而不是其蛋白肽metastin增加的效應(yīng)。在胰腺癌Capan?2細(xì)胞中KiSS?1的過表達(dá)究竟通過什么方式抑制細(xì)胞侵襲的機(jī)制和信號傳導(dǎo)通路需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性上調(diào)KiSS?1基因的表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞株Capan?2的侵襲，KiSS?1可能成為抗胰腺癌轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)。靶向增加胰腺癌細(xì)胞中KiSS?1表達(dá)的基因治療可能是治療胰腺癌轉(zhuǎn)移的新策略。

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（編輯 裘孝琦）

EffectsofKiSS?1onHumanPancreaticCarcinomaCapan?2CellProliferationandInvasion

WANGChun?hui1，QIAOChong2，ZHOUWen?ping1，MAShu?ren3
（1.Department of Hepatobiliary Surgery，General Hospital of Shenyang Millitary Region，Shenyang 110016，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；3.Endoscopy Medical Center，General Hospital of Shenyang Millitary Region，Shenyang 110016，China）

ObjectiveTo investigate the effects ofKiSS?1on the proliferation and invasion abilities of human pancreatic carcinoma Capan?2cells.Metods Transient transfection with Lipofectamine was used to up?regulate the expression ofKiSS?1in Capan?2cells.Tested the expression ofKiSS?1mRNAand Kisspeptin?metastin by real?time quantitative PCRand Western blot.MTTassay was used to detect the influence of KiSS?1on Capan?2cell proliferation.Transwell assay with Matrigel coated was used to evaluate the in vitro invasion ability.ResultsTheKiSS?1mRNAex?pression of Capan?2cells was significantly up?regulated 36hours after transfection.KiSS?1mRNAand metastin reached the peak 48hours after transfection.Comparedwithemptyplasmidtransfectedgroupandblankcontrolgroup，invasionabilityandinvasionindexofCapan?2cellwassignifi?cantly decrease 48hours afterKiSS?1transfection（P<0.01），meanwhile，the inhibition rates of Capan?2cell invasiveness was 56.5%.There were no significant difference of proliferation after transfection compared with empty plasmid group and blank control group（P<0.05）.ConclusionKiSS?1isametastasissuppressorgeneofpancreaticcancer，whichcanbeusedasanoveltargetforgenetherapy.

KiSS?1；pancreatic cancer；proliferation；invasion

R735.9

A

0258-4646（2014）04-0304-04

http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20140429.1439.006.html

全軍醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究“十一五”計(jì)劃青年學(xué)者課題（06Q014）；遼寧省博士啟動基金（20071038）

王春暉（1972-），男，副主任醫(yī)師，博士.E-mail：wangchh_2013@163.com

2013-12-17

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-04-2914:39