趙艷威，孫靜，宋光明，謝文利

（武警后勤學(xué)院藥理教研室，天津300162）

蘋(píng)果多酚是蘋(píng)果中所含多元酚類物質(zhì)的通稱，是果實(shí)在生長(zhǎng)發(fā)育期間產(chǎn)生的次生代謝物，主要包括黃烷-3-醇類、黃酮醇類、羥基苯甲酸類、二氫查爾酮、花青素等[1]。蘋(píng)果多酚具有抗氧化性、清除體內(nèi)自由基、預(yù)防高血壓、預(yù)防過(guò)敏、預(yù)防齲齒、抗衰老、抗腫瘤、抗突變等功效[2]。以往文獻(xiàn)報(bào)道，花青素具有降糖作用，但蘋(píng)果多酚與糖尿病的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道[3]。本試驗(yàn)擬對(duì)蘋(píng)果多酚是否具有降糖作用及其降糖作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雄性Wistar 大鼠（180 g～200 g）：SPF 級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2002-0003。

1.2 試劑及藥品

蘋(píng)果多酚（85%）：天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司；ATP、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、胰島素、地塞米松、17 種氨基酸標(biāo)樣、乙酰氨基葡萄糖、鏈脲佐菌素：Sigma 公司；葡萄糖氧化酶測(cè)試盒、DMEM 培養(yǎng)基、小牛血清：上海華美生物公司；3T3-L1 細(xì)胞：美國(guó)ATCC公司；其它試劑為國(guó)產(chǎn)試劑。拜唐蘋(píng)：拜耳醫(yī)藥保健有限公司；蔗糖試劑盒、總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司。

1.3 儀器

Bio-RAD、model-680 酶標(biāo)儀；SHZ82 型氣浴振蕩器：江蘇金壇中大儀器廠；LDZ0.8 離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；AT250 電子天平：瑞士METTLER 公司。

1.4 蘋(píng)果多酚對(duì)大鼠糖尿病模型血糖、血脂的影響

取雄性Wistar 大鼠50 只，體重180 g～200 g，以尾靜脈注射鏈脲佐菌素50 mg/kg（冰浴，pH4），誘發(fā)大鼠糖尿病。注射鏈脲佐菌素7 d 后，禁食10 h，剪尾采血測(cè)定血糖。選擇空腹血糖值在11.1 mmol/L 以上的大鼠，確定為糖尿病模型大鼠，隨機(jī)分為5 組，分別為1.5、0.75、0.3 g/kg 蘋(píng)果多酚組；陽(yáng)性藥拜唐蘋(píng)組（30 mg/kg）；模型組，每組8 只。每天上午定時(shí)ig 給藥1 次，給藥體積10 mL/kg，連續(xù)給藥7d。提前禁食10 h，于末次給藥后0.5 h 同法測(cè)定各組大鼠空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯。

1.5 蘋(píng)果多酚對(duì)大鼠糖耐量的影響

給藥方法與劑量同上，連續(xù)給藥7 d，末次給藥前禁食10 h，末次給藥后迅速ig 蔗糖溶液（4 g/kg），剪尾采血，用蔗糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法測(cè)定大鼠灌胃后0、0.5、1.0、2.0 h 的血糖值[4]。

1.6 蘋(píng)果多酚對(duì)小腸葡萄糖苷酶活性的影響

方法[4-5]，采用葡萄糖氧化酶測(cè)試盒測(cè)定，反應(yīng)條件為：底物：麥芽糖20 g/L，pH 4.30，反應(yīng)溫度：37 ℃，反應(yīng)時(shí)間30 min。

1.7 蘋(píng)果多酚對(duì)葡萄糖消耗能力的影響

將3T3-Ll 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，換用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，再換用含1 μg/mL 的胰島素培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，再換用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)，每48 h 換培養(yǎng)液一次，待90 以上3T3-L1 細(xì)胞呈現(xiàn)脂肪細(xì)胞表型時(shí)，采用葡萄糖消耗法[6]測(cè)定葡萄糖消耗能力。采用葡萄糖氧化酶法[7]測(cè)定各孔中葡萄糖的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果

2.1 蘋(píng)果多酚對(duì)大鼠糖尿病模型血糖、血脂的影響

大鼠在注射鏈脲佐菌素后7 d，空腹血糖值顯著升高，造模成功。用藥1 周后，不同劑量給藥組及拜唐蘋(píng)組大鼠血糖值與模型組比較均顯著下降（P＜0.05），并且給藥組降糖作用與劑量呈正相關(guān)（r=0.995）；給藥組大鼠總膽固醇、甘油三酯略低于模型組，但無(wú)顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蘋(píng)果多酚對(duì)大鼠糖尿病模型血糖、血脂的影響（x±S，n=8）Table 1 The effects of Apple Polyphenol to serum glucose，total cholesterol，triglyceride on diabetic rats mmol/L

2.2 蘋(píng)果多酚對(duì)大鼠糖耐量的影響

各組動(dòng)物ig 蔗糖0.5 h 后血糖值達(dá)峰值，在ig 蔗糖后0.5 h 開(kāi)始至2.0 h，3 個(gè)劑量給藥組與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較血糖值有顯著性降低（P＜0.05），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)條件下蘋(píng)果多酚可提高糖尿病大鼠的蔗糖耐量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 蘋(píng)果多酚對(duì)大鼠糖耐量的影響（χ±S，n=8）Table 2 The effects of Apple Polyphenol to glucose tolerance on diabetic rats

2.3 蘋(píng)果多酚對(duì)小腸葡萄糖苷酶活性的影響

蘋(píng)果多酚對(duì)葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶和麥芽糖酶活性具有明顯抑制作用，且抑制率與蘋(píng)果多酚的濃度呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性，表明蘋(píng)果多酚對(duì)小鼠小腸黏膜a-葡萄糖苷酶活性的抑制作用顯著。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蘋(píng)果多酚對(duì)a-葡糖苷酶的抑制作用Table 3 The effects of Apple Polyphenol to a-glucosidase

2.4 蘋(píng)果多酚對(duì)葡萄糖向3T3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)作用的影響

3T3-L1 脂肪細(xì)胞在含有不同濃度的蘋(píng)果多酚培養(yǎng)液中培養(yǎng)數(shù)天后，各蘋(píng)果多酚組細(xì)胞外葡萄糖濃度與對(duì)照組比較均明顯下降（P＜0.05），并且具有濃度依賴性。說(shuō)明蘋(píng)果多酚能促進(jìn)葡萄糖往細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，使細(xì)胞外葡萄糖消耗增加。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 蘋(píng)果多酚對(duì)葡萄糖向3T3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)作用的影響（χ±S，n=8）Table 4 The effects of apple polyphenol to 3 T3-L1 cell transportation of the glucose

3 討論

蘋(píng)果多酚是蘋(píng)果中天然存在的一類重要生物活性物質(zhì)，簡(jiǎn)稱APP（apple polyphenols），其中包括：類黃酮類、單寧類、酚酸類及花色苷等[8]。近幾年大量研究顯示，蘋(píng)果多酚具有多種藥理功能，如抗癌、抗氧化性、抗動(dòng)脈硬化、抗過(guò)敏等[9]。本試驗(yàn)采用蘋(píng)果多酚對(duì)鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠的糖耐量、血糖、血脂的影響及降糖機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，連續(xù)給藥1 周后3 個(gè)劑量的蘋(píng)果多酚在負(fù)荷蔗糖后0.5 h，勻可以顯著性提高大鼠蔗糖耐量（P＜0.05），降低負(fù)荷蔗糖后機(jī)體的血糖值；同時(shí)，蘋(píng)果多酚還可以顯著性降低鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病模型大鼠的血糖值（P＜0.05），且該作用呈劑量依賴性；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)顯示蘋(píng)果多酚對(duì)葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶和麥芽糖酶活性具有明顯抑制作用，且抑制率與蘋(píng)果多酚的濃度呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。a-葡糖苷酶是使飲食中不易吸收的碳水化合物分解成小腸易吸收的單糖的酶，包括蔗糖酶、葡萄糖淀粉酶，麥芽糖酶和糊精酶[10]。蘋(píng)果多酚可能與糖苷酶結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制小腸上段a-葡萄糖苷酶，阻斷碳水化合物在小腸上段分解成單糖，從而抑制葡萄糖吸收入血液，使血糖降低；另外，本實(shí)驗(yàn)各蘋(píng)果多酚組3T3-L1 細(xì)胞外葡萄糖濃度與對(duì)照組比較均明顯下降（P＜0.05），并且具有濃度依賴性。說(shuō)明蘋(píng)果多酚能促進(jìn)葡萄糖往細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，使細(xì)胞外葡萄糖消耗增加。3T3-L1 細(xì)胞一種常用的成纖細(xì)胞，在胰島素、地塞米松、和1-甲基3-異丁基黃嘌呤等作用下，具有轉(zhuǎn)變?yōu)橹炯?xì)胞的能力，通過(guò)體外研究藥物對(duì)脂肪細(xì)胞糖代謝的影響來(lái)反映藥物的降血糖效果[11]。因此，蘋(píng)果多酚促進(jìn)葡萄糖往細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，使細(xì)胞外葡萄糖消耗增加也可能是其降糖作用的機(jī)制之一。由此可見(jiàn)，蘋(píng)果多酚具有明顯的降糖作用，其治療糖尿病的開(kāi)發(fā)和深入研究非常值得期待。

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