姜建輝，趙儉波，王貴云

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

銀合歡為豆科（Leguminosae）含羞草亞科（Mimosoideae）銀合歡屬（Leucaena Bentham）多年生灌木或喬木，原產(chǎn)美洲，現(xiàn)廣泛分布于世界熱帶亞熱帶地區(qū)[1]，目前，我國栽培利用的主要品種是銀合歡[L.leucocephala（Lamarck）de Wit]，該品種適應(yīng)性強、速生高產(chǎn)、營養(yǎng)價值高、適口性好、易于栽培。合歡葉有安神解郁、活血消腫、用于心神不安、憂郁失眠、癰瘡腫毒、筋骨折傷，還具有吸收空氣中硫氧化物的作用，因而它能夠凈化空氣、美化環(huán)境，是調(diào)節(jié)人們精神生活的優(yōu)良樹種[2]。銀合歡葉含有黃酮、生物堿、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[3]。李學(xué)堅等進行了銀合歡葉提取物對實驗動物的降血糖效果的研究，可望使銀合歡葉成為開發(fā)降血糖藥物的資源[4]。近年來，銀合歡葉資源化利用研究漸成熱點[4-6]，但鮮見測定銀合歡葉黃酮含量的報道。

黃酮類化合物廣泛存在于自然界植物中，大部分具有較強的抗氧化活性，能起到廣譜抑菌、消炎和抗毒素的作用[7]。植物中黃酮化合物以其純天然、高活性、見效快等特點得到國內(nèi)外科研人員的極大關(guān)注，目前已開發(fā)了多種藥用植物黃酮產(chǎn)品。因此，研究從銀合歡葉中提取黃酮類化合物對銀合歡的開發(fā)利用具有重要意義。論文對銀合歡葉的黃酮提取工藝進行了探索和優(yōu)化，從溶劑的濃度、提取時間、提取溫度和料液比的單因素實驗，以及正交實驗進行考察研究，找到銀合歡葉黃酮提取的最優(yōu)工藝，為銀合歡葉黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DF-101S 集熱磁力加熱攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；電子天平：上海菁海儀器有限公司；SENCORW2-180SP：上海申生科技有限公司；722N 可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；KQ-C 玻璃儀器氣流烘干器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SK1517電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；標準檢驗篩：上虞市儀器設(shè)備廠。

銀合歡葉樣品于2012年10月中旬采自新疆阿拉爾塔里木大學(xué)校園，銀合歡葉采集后清洗干凈、晾干、粉碎并過40 目篩，收集備用。蘆丁對照品（生物純純度≥95%，上海藍季科技發(fā)展有限公司）；無水乙醇、硝酸鋁、氯仿（均為分析純）、亞硝酸鈉（化學(xué)純）、蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取60 ℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品20.0 mg，用30%的乙醇定容于100 mL 容量瓶中，制成濃度為0.2 mg/mL 的對照品溶液。

1.2.1.2 工藝流程

銀合歡葉粉末→醇提（兩次）→合并濾液→過濾→濃縮→少量水分散，氯仿萃?。ǔト~綠素等脂溶性雜質(zhì)）→過濾→濃縮→30%乙醇溶解→過濾并定容→測定。

1.2.1.3 樣品溶液的制備

稱取銀合歡樹葉粉末1.00 g，置于250 mL 圓底燒瓶中，按“1.2.1.1”方法在一定的乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比條件下進行提取，濾液過濾定容于25 mL 容量瓶中，即得。

1.2.2 測定波長的選擇

精密量取“1.2.1.1”項下對照品溶液4.00 mL 于25 mL容量瓶中，加30%乙醇至10 mL，加入5%NaNO20.7mL 搖勻，放置6min，加入10%Al（NO3）3溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，加入4%NaOH 溶液5 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，在400 nm～750 nm 處掃描，結(jié)果對照品溶液在508 nm 處具有最大吸收。

1.2.3 標準曲線的繪制[8]

精密量取“1.2.1.1”項下對照品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，加30%乙醇至10 mL，加入5%NaNO20.7 mL，搖勻，放置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，加入4%NaOH 溶液5 mL，再加30 %乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，在508 nm 處，測定吸收度值。以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 樣品溶液的測定

移取“1.2.1.3”項下樣品溶液1 mL 于25 mL 容量瓶中，按“1.2.3”方法測定樣品的吸光度，從工作曲線中查出黃酮濃度，由此計算出黃酮得率。

式中：C 為標準曲線上獲得的濃度，（mg/mL）；V0為黃酮初提液定容后的體積，mL；V1為提取液測定時定容后的體積，mL；V2為提取液測定時的體積，mL；W為葉子干粉的質(zhì)量，g。

圖1 標準曲線圖Table 1 Curve diagram

1.2.5 重復(fù)性試驗

為驗證選定的最佳提取工藝的重復(fù)性，分別稱取6 份銀合歡葉粉末1.00 g，以最佳提取工藝進行6 次平行試驗，按“1.2.1.3”項下方法制備樣品溶液，移取1.00 mL 于25 mL 容量瓶中，顯色，測定。

1.3 單因素實驗

稱取銀合歡樹葉粉末1.00 g，精密稱量，置于250 mL圓底燒瓶中，在不同條件下提取，考察不同提取時間、乙醇濃度、料液比和提取溫度對銀合歡葉中黃酮提取效果的影響。

1.4 正交實驗

通過單因素試驗對銀合歡葉黃酮的提取條件進行初步研究，，發(fā)現(xiàn)各條件對銀合歡葉黃酮的提取率均有一定的影響，選擇L9（34）表安排正交試驗，優(yōu)化銀合歡葉葉黃酮提取工藝。試驗設(shè)計見表1。

表1 銀合歡葉黃酮最佳提取條件正交試驗設(shè)計Table 1 Leucaena leucocephala leaf total flavone extraction condition orthogonal test design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取溫度對黃酮提取率的影響

以60%乙醇為提取溶劑，在物料粒度40 目，超聲功率150 W，料液比1 ∶20（g/mL），時間20 min，提取兩次。以提取率為評價指標，考察溫度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.2 Impact of extraction temperature on extraction of flavones

溫度越高，分子運動越劇烈，滲透、擴散、溶解速度越快。同時，高溫可以引起細胞膜結(jié)構(gòu)的變化，使黃酮類化合物更容易被萃取到溶劑中。因此，隨著提取溫度的升高，黃酮得率隨之增加，在35 ℃時黃酮提取率最高。當(dāng)溫度超過35 ℃時，黃酮得率有所下降。可能是因為水溶性黃酮可能發(fā)生水解導(dǎo)致提取率下降，因此，提取溫度選擇35 ℃左右為宜。

2.1.2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

在物料粒度40 目，超聲功率150 W，料液比1∶20（g/mL），溫度35 ℃，時間20 min，提取兩次。以提取率為評價指標，考察乙醇濃度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction of flavones

由結(jié)果如圖3 可知，隨乙醇濃度的增加，黃酮提取率增大，當(dāng)濃度達到60%時提取率最大，隨著乙醇濃度繼續(xù)增加，提取率則開始下降，這可能是乙醇濃度不同，極性也不同，60%乙醇的極性與銀合歡葉的黃酮類化合物極性相近，當(dāng)乙醇濃度超過60%時，一些脂溶性的物質(zhì)溶出增加，影響了黃酮類物質(zhì)的浸出，因此黃酮得率減少。故宜選用60%乙醇為提取溶劑。

2.1.3 料液比對黃酮提取率的影響

以60%乙醇為提取溶劑，在物料粒度40 目，超聲功率150 W，溫度35 ℃，時間20 min，提取兩次。以提取率為評價指標，考察料液比的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction of flavones

結(jié)果如圖4 可知，在1 ∶25（g/mL）時提取率最大。隨著溶劑量增加，黃酮的溶出量變大。當(dāng)黃酮充分溶出后，即使繼續(xù)加大溶劑量，黃酮的含量基本趨于穩(wěn)定，而溶劑的及能源的成本相對較高。因此，本實驗確定最佳料液比為1 ∶25（g/mL）。

2.1.4 提取時間對黃酮提取率的影響

以60%乙醇為提取溶劑，在物料粒度40 目，超聲功率150 W，溫度35 ℃，料液比1 ∶25（g/mL）提取兩次。以提取率為評價指標，考察提取時間的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時間對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction of flavones

結(jié)果如圖5 可知，提取20 min 時得率最高，超過了20 min 后，黃酮得率反而下降，可能是超聲時間過長，提取過程中雜質(zhì)含量增加，致使有效成分下降[14]。故確定最佳提取時間為20 min。

2.2.1 銀合歡葉葉黃酮最佳提取條件正交試驗結(jié)果

鑒于乙醇濃度、提取時間、料液比、對銀合歡葉黃酮的提取均有一定的影響，通過正交試驗確定最佳提取條件，結(jié)果見表2。

表2 黃酮提取正交試驗結(jié)果Table 2 The results of the orthogonal experiment

由表2 可知，各因素對銀合歡葉黃酮提取率的影響程度由大到小依次為：乙醇濃度＞料液比＞提取溫度＞提取時間，極差分析結(jié)果表明，A1B1C2D3組合的提取率最高。最終確定銀合歡葉黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度為50%、料液比為1 ∶25（g/mL）、提取溫度為35 ℃、提取時間為15 min。

2.2.2 最佳條件的驗證試驗

按照上述確定的最佳試驗條件A1B1C2D3，重復(fù)進行3 次試驗，黃酮提取率分別為2.072 % 、2.054 %、2.066%，平均為2.064%。

2.2.3 重復(fù)性試驗

按選定的A1B1C2D3條件進行6 次平行試驗，結(jié)果見表3。結(jié)果RSD 為1.04%（n=6），用此工藝提取銀合歡葉中黃酮，重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗測定結(jié)果Table 3 Results in repeated test

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗表明，影響黃酮提取率的因素主次順序為乙醇濃度＞料液比＞提取溫度＞提取時間，優(yōu)化了銀合歡葉中黃酮提取的工藝條件，初步篩選出提取黃酮的最佳工藝組合為A1B1C2D3。得出最佳提取工藝條件為：乙醇濃度50%，料液比1 ∶25，提取時間20 min，提取溫度40 ℃，超聲波輔助提取以其節(jié)省時間，易于控制等優(yōu)點將逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)提取方法。

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[5] 王恩舉,梁德華,楊智蘊.銀合歡葉黃酮類成分的研究[J].海南師范大學(xué)學(xué)報,2008,21(2):171-172

[6] 王強,王恩舉,迪麗菲嘎爾等.銀合歡葉成分槲皮素-3-O-鼠李糖甙的FT-IR 和FT-Raman 光譜[J].光散射學(xué)報,2000, 12(1):27-29

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