郭志芳，馬川蘭，賈娟

（漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程系，河南漯河462000）

蜂膠（propolis）是工蜂采集楊屬（Populus）等植物的樹皮、幼芽、花蕾等的分泌物中的黏性樹脂成分，與自己的唾液即上腭腺分泌物、蜂蠟等相混調(diào)合而成的一種天然物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤等作用[1-3]。自由基是指具有未配對(duì)價(jià)電子的原子、原子團(tuán)、分子和離子，過量的自由基可危害人體健康。實(shí)驗(yàn)證明，蜂膠提取物有較好的清除羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·O2-）的能力，其中所含的黃酮類化合物和萜烯類化合物均具有清除自由基的作用[4-5]。

從文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)目前國內(nèi)用化學(xué)發(fā)光法對(duì)蜂膠清除自由基的研究比較少，且大多未排除萜烯類化合物的干擾，因此，采用化學(xué)發(fā)光法對(duì)蜂膠提取物清除超氧陰離子和羥自由基的能力進(jìn)行測(cè)定，將黃酮類化合物含量較高的提取物清除自由基的能力與萜烯類化合物含量較高的提取物及兩種黃酮單體清除自由基的能力進(jìn)行比較，探討蜂膠中黃酮類化合物清除自由基的能力。

1 實(shí)驗(yàn)材料、藥品與儀器

1.1 材料

毛蜂膠，由汪氏蜂業(yè)集團(tuán)有限公司提供；槲皮素（sigma 公司）、蘆?。╯igma 公司），均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 藥品

無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、純度99.5%以上的CO2、硅膠、CuSO4、VC、H2O2、鄰菲啰啉、鄰苯三酚、魯米諾（sigma 公司）、HCl、NaOH 等，均為分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器

HA121-50-01 超臨界CO2萃取裝置：江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；R502B2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；SHZ-III 型循環(huán)真空泵：上海亞榮生化儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；BPCL 微弱發(fā)光測(cè)量儀：中國科學(xué)院生物物理研究所；電子分析天平、pH 計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS Agilent-6890N/5973i）：安捷倫科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)樣品的制備

2.1.1 蜂膠乙醇提取樣品

蜂膠原料→脫蠟→冷凍→粉碎→稱重→70%乙醇提取→過濾→濃縮→蜂膠浸膏→記為樣品1。

2.1.2 蜂膠揮發(fā)油樣品

蜂膠原料→脫蠟→冷凍、粉碎、制粒、投料→超臨界CO2萃取→超臨界CO2萃取物→乙酸乙酯萃取→濃縮→冷凍過濾→濃縮→石油醚反萃取→濃縮→揮發(fā)油樣品→記為樣品2。

2.1.3 黃酮單體

蘆丁→記為樣品3；槲皮素→記為樣品4。

2.2 實(shí)驗(yàn)樣品GC-MS 分析

色譜條件：HP-5 彈性石英毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID 檢測(cè)器，載氣為高純He（99.999%），流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，采用程序升溫。

質(zhì)譜條件：離子源為EI；質(zhì)量掃描范圍：m/z50 amu～550 amu。色譜工作站為HP-5，數(shù)據(jù)庫為nist2002。

2.3 樣品清除自由基實(shí)驗(yàn)

2.3.1 待測(cè)試樣溶液的制備

1）取樣品1、樣品3、樣品4 用無水乙醇配制溶液，濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL；

2）取樣品2 用無水乙醇與乙酸乙酯混合溶劑（比例為1 ∶1）配制溶液，濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL。

2.3.2 羥自由基的清除實(shí)驗(yàn)[6]

在發(fā)光杯中依次加入2 mmol/L 的新鮮VC溶液200 μL，2 mmol/L 的CuSO4溶液400 μL，2 mmol/L 的鄰菲啰啉溶液400 μL，加0.1 mol/L pH8.0 的磷酸緩沖液600 μL，再加50 μL 待測(cè)試樣溶液，混勻，放入發(fā)光儀的反應(yīng)池內(nèi)，用600 μL 的100 mmol/L H2O2溶液啟動(dòng)發(fā)光，測(cè)定250 s 內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度?？瞻讓?duì)照以試樣溶劑代替試樣溶液。

2.3.3 超氧陰離子自由基的清除實(shí)驗(yàn)[7]

在發(fā)光杯中依次加入待測(cè)試樣溶液20 μL，1 mmol/L的鄰苯三酚溶液10 μL，放入發(fā)光儀的反應(yīng)池內(nèi)，原位注入970 μL 魯米諾（1 mmol/L）—碳酸緩沖液（pH 10.2），啟動(dòng)發(fā)光，測(cè)定250 s 內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度?？瞻讓?duì)照以試樣溶劑代替試樣溶液。

2.3.4 發(fā)光抑制率的計(jì)算

發(fā)光抑制率=（空白發(fā)光曲線總面積-樣品發(fā)光曲線總面積）/空白發(fā)光曲線總面積×100%

3 結(jié)果與討論

3.1 GC-MS 分析結(jié)果

將GC/MS 分析結(jié)果按類別分類，得提取樣品的化學(xué)組成，見表1。

表1 提取樣品的化學(xué)組成Table 1 The chemical composition of the extractions %

從蜂膠樣品的化學(xué)組成可知：樣品1 中，黃酮類化合物總相對(duì)含量為40.04 %，其中柯因含量高達(dá)12.25%，松屬素含量達(dá)到9.90%，2，6-二羥基-4-甲氧基查耳酮含量達(dá)到4.71%，高良姜素含量達(dá)到4.40%，而萜烯類化合物總相對(duì)含量僅為11.04%；樣品2 中，萜烯類化合物總相對(duì)含量為12.98%，而黃酮類化合物為2’，6’-二羥基-4-甲氧基查爾酮和柚木柯因兩種，其含量僅為2.32%。

3.2 清除自由基實(shí)驗(yàn)的結(jié)果討論

3.2.1 清除羥自由基

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)羥自由基的抑制率為縱坐標(biāo)，做各樣品的抑制率曲線見圖1。

圖1 樣品對(duì)羥自由基抑制率曲線Fig.1 The hydroxyl radical inhibition rate curve of the samples

從圖1 中可以看出，樣品1 與樣品4 清除羥自由基的能力相當(dāng)，樣品3 較弱，樣品2 最弱。同時(shí)，增大樣品濃度，對(duì)羥自由基的抑制率均有很大提高。從圖1中可以直接讀出發(fā)光抑制率為50%時(shí)，樣品1 的濃度IC50≈0.25 mg/mL，樣品2 的濃度IC50≈1.272 mg/mL，樣品3 的濃度IC50≈0.327 mg/mL，樣品4 的濃度IC50≈0.27 mg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蜂膠乙醇提取物清除羥自由基的能力很強(qiáng)，且與黃酮單體槲皮素相當(dāng)，略強(qiáng)于蘆丁，明顯強(qiáng)于揮發(fā)油樣品。

3.2.2 清除超氧陰離子自由基

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)超氧陰離子自由基的抑制率為縱坐標(biāo)，做各樣品的抑制率曲線見圖2。

圖2 樣品對(duì)超氧陰離子自由基抑制率曲線Fig.2 The superoxide anion radical inhibition rate curve of the samples

從圖2 中可以看出，樣品4 清除超氧陰離子自由基的能力最強(qiáng)，樣品1 次之，樣品3 較弱，樣品2 最弱。同時(shí)，增大樣品濃度，對(duì)超氧陰離子自由基的抑制率均有很大提高。從圖2 中還可以直接讀出發(fā)光抑制率為50%時(shí)，樣品1 的濃度IC50≈0.085 mg/mL，樣品2 的濃度IC50≈0.748mg/mL，樣品3 的濃度IC50≈0.195mg/mL，樣品4 的濃度IC50≈0.022 mg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蜂膠乙醇提取物清除超氧陰離子自由基的能力強(qiáng)于蘆丁和揮發(fā)油樣品，但比黃酮單體槲皮素稍差。

蜂膠中的黃酮類化合物和萜烯類化合物均對(duì)自由基有一定的清除作用，結(jié)合成分分析結(jié)果，黃酮類化合物含量較高的樣品1 清除自由基能力較強(qiáng)，而萜烯類化合物含量較高的樣品2 清除自由基的能力較弱，這說明蜂膠中的黃酮類化合物在乙醇提取物清除自由基的過程中起主要作用。

3 結(jié)論

蜂膠乙醇提取樣品、蜂膠揮發(fā)油樣品、蘆丁、槲皮素對(duì)羥自由基的發(fā)光抑制率IC50分別為0.25、1.272、0.327、0.27 mg/mL；對(duì)超氧陰離子自由基的發(fā)光抑制率IC50分別為0.085、0.748、0.195、0.022 mg/mL。GC/MS 分析結(jié)果表明，蜂膠乙醇提取樣品中的黃酮類化合物總相對(duì)含量為40.04 %，萜烯類化合物總相對(duì)含量為11.04%；蜂膠揮發(fā)油樣品中黃酮類化合物總相對(duì)含量為2.32%，萜烯類化合物總相對(duì)含量為12.98%。

結(jié)果表明，黃酮類化合物含量較高的蜂膠乙醇提取物清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力均強(qiáng)于蘆丁，且明顯強(qiáng)于萜烯類化合物含量較高的蜂膠揮發(fā)油樣品，同時(shí)，其清除羥自由基的能力與黃酮單體槲皮素相當(dāng)，清除超氧陰離子自由基的能力比槲皮素稍差。綜上所述，蜂膠中黃酮類化合物具有很好的清除自由基的能力。

[1] Burdock G A．Review of the Biological Properties and Toxicity of Bee Propolis[J]．Food and Chemical Toxicology,1998(36):347-363

[2] Mok-Ryeon Ahn, Shigenori Kumazawa, Yumiko Usui,et al．Antioxidant activity and constituents of propolis collected in various areas of China[J]．Food Chemistry,2007(101):1383-1392

[3] Pascual C,Gonzalez R,Torricel R G．Scavenging action of propolis extract against oxygen radicals[J]．Ethnopharmacology,1994,41(1/2):9-13

[4] Ameha Seyoum, Kaleab Asres, Fathy Kandeel El-Fiky．Structure–radical scavenging activity relationships of flavonoids[J]．Phytochemistry,2006,67:2058-2070

[5] 李熙燦,趙小軍,謝學(xué)明,等．蓽茇?fù)]發(fā)油清除自由基作用及其與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系[J]．中藥新藥與臨床藥理,2006(3):61-64

[6] 曹煒,尉亞輝,郭斌． 用化學(xué)發(fā)光法研究蜂膠對(duì)氧自由基的清除作用[J]．光子學(xué)報(bào),2002(2):35-37

[7] 田云,盧向陽,易克,等．化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)番茄提取物清除自由基的能力[J]．生命科學(xué)儀器,2003(6):16-17