孫嘉 郎朗

（哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心 黑龍江哈爾濱 150076）

在我國，有機磷農(nóng)藥占所有使用農(nóng)藥的80%以上[1]，由于有機磷農(nóng)藥的不合理使用，近年來有機磷農(nóng)藥殘留問題和中毒事件日益增加。因此，研究有機磷農(nóng)藥降解方法成為當前熱點問題之一。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物對有機磷農(nóng)藥的降解作用得到了人們的充分肯定，酶促反應(yīng)是微生物降解法的主要形式之一。

1.1 氧化降解法

化學氧化降解法是通過化學反應(yīng)將有機磷農(nóng)藥中的有毒物質(zhì)的毒性降低或消除，從而達到處理的目的。常用的氧化劑有過氧化氫、過碳酸鈉、鈰配合物等。H2O2降解農(nóng)藥時常與Fe3+或Fe2+組成Fenton，通過氧化還反應(yīng)處理農(nóng)藥污染物。H2O2在反應(yīng)過程中生成無污染的水和氧氣，且不改變廢水的pH，投入過量時也不會產(chǎn)生二次污染。但Fenton的降解率隨pH的升高而降低，易受pH條件影響。過碳酸鈉作為一種新型氧化劑，溶于水之后pH增加，可促進降解進行，處理過程中通過水解產(chǎn)生溶解氧達到降解有機磷農(nóng)藥的目的。但由于過碳酸鈉溶于水后易分解，所以增加其用量與延長降解時間不能有效提升降解率。利用鈰配合物能切斷有機磷農(nóng)藥中的磷脂鍵原理，從而達到有機磷農(nóng)藥降解作用。但鈰配合物對有機磷農(nóng)藥的降解有一定的選擇性，且體內(nèi)的理化反應(yīng)體系復雜，并受諸多環(huán)境因子影響，所以鈰配合物降解法并不能廣泛適用。

1.2 光催化降解法

光催化法常與催化劑TiO2結(jié)合對污染物進行作用，但TiO2光催化降解有機磷農(nóng)藥只有在光照、光催化劑和氧氣同時存在的條件下才能產(chǎn)生作用，降解率隨三種影響因素的用量的增加而增大，達到最佳效果后，降解率隨用量的繼續(xù)增大反而降低。為延長電子與空穴的復合時間，常將少量的特定金屬離子與TiO2混合，從而提高光催化性，此時金屬離子又會產(chǎn)生二次污染。因此TiO2光催化法受環(huán)境因素制約較大，而且易產(chǎn)生二次污染，并不適宜廣泛應(yīng)用。

1.3 生物降解法

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物降解有機磷農(nóng)藥技術(shù)得到充分肯定。許多有機磷農(nóng)藥的降解菌已被分離出來，其中一些微生物的有機磷降解酶的生化性質(zhì)已得到鑒定，少數(shù)有機磷農(nóng)藥降解基因已得到分離、鑒定、改造。降解酶往往比生產(chǎn)這類酶的原菌體微生物對環(huán)境的適應(yīng)性更強。如對硫磷水解酶，在22℃時該酶的降解效率比化學降解快1000～2450倍，且比產(chǎn)生該酶的微生物菌體對環(huán)境條件的忍受范圍更大，在較高溫度下亦能保持較高的活性，而該酶的生產(chǎn)菌在相同條件下卻不能生長[2]。用微生物或其降解酶制品來消減農(nóng)藥污染的生物降解法顯出廣闊的應(yīng)用前景。

2 有機磷農(nóng)藥降解酶的研究進展

2.1 有機磷農(nóng)藥降解酶的作用機理

有機磷農(nóng)藥降解酶主要是水解酶類。有機磷降解酶通過切斷有毒物質(zhì)中表達毒性的、不溶于水的大分子的分子鍵（例如：P-O鍵、P-F鍵、P-S鍵、P-CN鍵），使之成為無毒的、溶于水的小分子。由于不同有機磷農(nóng)藥的取代基不同，因此一種有機磷降解酶往往能降解多種有機磷農(nóng)藥。

2.2 有機磷農(nóng)藥降解酶的研究進展

早在70年代人類就發(fā)現(xiàn)有些土壤中的某些微生物對農(nóng)藥具有降解作用。Munneck等[2]從假單胞桿菌中檢測出磷酸酯酶的活性，發(fā)現(xiàn)其對對硫磷等7中有機磷農(nóng)藥均具有降解作用。Defrank等[3]等從一株嗜鹽細菌中提取出一種有機磷農(nóng)藥降解酶，可被Mg2+和Co2+激活。Cheng等[4]從單胞菌中純化得到一種有機磷農(nóng)藥降解酶，最佳pH為8.0，最適溫度為55℃，對含P-F鍵和P-C鍵的有機磷化合物作用較好。

近年來，我國對有機磷降解酶也做了多方面研究。劉玉煥等[5]從曲霉菌中分離純化出有機磷農(nóng)藥降解酶，此酶對有機磷農(nóng)藥樂果具有較好降解作用，酶活性范圍在pH6～10之間；重金屬、Cu2+對該酶具有促進作用，而SDS對其有抑制作用。金彬明等[6]從海洋微生物M-1中分離純化出有機磷降解酶，最適反應(yīng)溫度30℃，最適 pH7.5，K+、Na+、Ca2+、Mn2+等離子對酶活性有促進作用；Hg2+、Zn2+、Cu2+等離子對酶活性有抑制作用。

有機磷降解酶在天然菌株中的含量太低，要將其普遍應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，解決有機磷降解酶廉價、大量生產(chǎn)成為推廣有機磷降解酶制劑的首要難題。隨著分子生物技術(shù)和基因技術(shù)的發(fā)展，人們試圖通過構(gòu)建高效反應(yīng)器來提高酶的表達量，為其大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

2.3 有機磷農(nóng)藥降解酶基因工程的研究

多種有機磷降解酶不斷從各種微生物中提取出來，人們對有機磷降解酶的基因表達和克隆研究也取得了新的進展。Serdar等[7]首次在大腸桿菌中表達有機磷降解酶，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物具有生物活性，但表達量未見提高，而后又改變此酶的基因序列及信號肽編碼序列后在大腸桿菌中表達，使之表達量有所提高。

經(jīng)過多年的科學研究，有機磷降解酶的基因表達和克隆得到顯著成效。鄧敏捷等將有機磷水解酶基因與載體pET-31a重組，在E.coliBL21中得到成功表達，經(jīng)誘導4小時后，重組蛋白的酶活性是原菌的10倍[8]。劉智等[9]通過鳥槍法克隆甲基對硫磷水解酶基因在大腸桿菌中表達，及構(gòu)建能同時降解多種有機農(nóng)藥的降解菌，使其降解酶在實驗室條件下活性提高6倍。

可見，有機磷降解酶的基因表達和克隆可有效增強有機磷降解酶的生物活性，有研究表明將酶定位在細胞表面，更能提高反應(yīng)效率。這表明在此后的研究中，有機磷降解酶的基因水平研究將會成為有機磷農(nóng)藥降解領(lǐng)域的主要發(fā)展方向之一。

3 有機磷農(nóng)藥降解酶的應(yīng)用

3.1 固定化酶用于有機磷污染物脫毒

固定化有機磷酶制劑制成酶反應(yīng)器現(xiàn)已用于污水處理中，有機磷酶制劑不僅可以重復利用，在惡劣條件下保持其生物活性，還不易造成二次污染，在土壤修復中可避免土壤吸附、失活。因此有機磷降解酶在環(huán)境科學與生物傳感技術(shù)上能得到廣泛應(yīng)用。

3.2 生物傳感器用于檢測有機磷化合物

有機磷降解酶可水解出多種有機磷化合物，可釋放出容易檢測的硝基酚、氟化物或氫離子，國外基于此種特性已研制出光學、電勢計和安培計生物傳感器，可快速準確的檢測出有

3.3 醫(yī)療中用于制備有機磷中毒的解毒劑和抑制劑

有機磷神經(jīng)毒劑中含有磷酸三酯鍵，磷酸三酯鍵斷裂后，其毒性會大大降低。有機磷降解酶可切斷含磷鍵，所以利用其作用機理也可研制有機磷解毒劑與預(yù)防劑，從而應(yīng)用于醫(yī)學領(lǐng)域。

4 展望

目前國內(nèi)外對有機磷降解微生物及其純化的降解酶已有廣泛研究，將有機磷降解酶有效的應(yīng)用于實際生產(chǎn)中將成為首要問題。未來的研究方向從多個角度出發(fā)：進一步從微生物中純化出可實際應(yīng)用的有機磷降解酶、根據(jù)分子生物學進行鑒定從而建立菌種庫、加強有機磷降解酶的活化性質(zhì)研究，從而真正將有機磷降解酶應(yīng)用于生產(chǎn)生活中、體用細胞工程，基因工程等技術(shù)提高酶的活性、從酶的適應(yīng)性強等多優(yōu)勢出發(fā)，有效的將有機磷降解酶應(yīng)用于更多領(lǐng)域。

[1].張嬋，廖曉蘭.有機磷農(nóng)藥的微生物降解技術(shù)研究進展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學學報，2010，41(10)：1079-108210.

[2].Munnecke DM,Hsieh PD.Microbial decontamination ofparathion and p-nitrophenol in aqueousmedia[J].Applied Microbiol,1974,28(2):212-217.

[3].Defrank J J,Cheng T C.Purification and properties of an organophosphorus acid anhydrase from a halophilic bacterial isolate[J].JBacteriol,1991,173:1938-1943.

[4].Cheng,TC,Harvey SP,Stroup AN.Purification and propertiesofa highly active organophosphorus acid anhydrolase from Alteromonas undina[J].Appl.Environ.Microbiol,1993,59:3138-3140.

[5].劉玉煥,鐘英長.華麗曲霉Z58有機磷農(nóng)藥降解酶的純化和性質(zhì)[J].微生物學報，2000,40(4):430-434.

[6].金彬明,文性明.海洋微生物有機磷降解酶的純化與性質(zhì)研究[J].中國微生態(tài)學雜志，2007，19(1)：37-39.

[7].Serdar,C M,Murdock D C,Rohde M F.Parathion hydrolasegene from Pseudomonas diminuta MG:subcloning,complete nucleotide sequence,and expression of themature portion of the enzyme in Escherichia coli[J].Bio/Technology,1989,7:1151-1155.

[8].鄧敏捷,伍寧豐,梁果義,等．一種新的有機磷降解酶基因ophc2的克隆與表達[J].科學通報，2004，49(I1)：1067-1072.

[9].劉智,洪青,徐劍宏,等.甲基對硫磷水解酶基因的克隆與融合表達[J].遺傳學報,2003,9(11):1020-1026.